混合质控菌种盲样的鉴定分析
摘 要：本文的目的是通过盲样考核提升实验室微生物检测能力和质量管理水平，依据食品卫生微生物学检验标准GB 4789及CMA评审专家提供的《致病菌鉴定作业指导书》进行检验。结果表明，盲样样品中检出鼠伤寒沙门氏菌(1，4，[5]，12：i：1，2)和金黄色葡萄球菌，本次混合菌种鉴定项目取得了满意的实验结果。通过参加实验室盲样考核，检验人员提高了自身检测水平，增加了检测结果的可靠性。
关键词：微生物 盲样 鉴定 质控
1 引言
微生物盲样考核是对检测人员技能、实验室质量控制和管理水平的检验，实验室专业技术人员必须考虑实验室的设备、培养基、试剂、诊断血清等因素，从接种、培养、分离鉴定等环节进行严格的质量控制，减少主观因素对检验结果的影响，进而保证检验结果的准确性。在实验评审过程中，特别是现场评审中，盲样测试方式可以更直接地反映被评审实验室的仪器设备和技术素质的实际水平[1]。
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2 材料与方法
2.1 微生物盲样样品
样品为来自CMA评审专家提供的半固体1支，盲样编号为MY-WJ-01。盲样中有两种或以上菌株，且为食品检测中常见的致病菌，要求最终报告得出的结果是所有检出菌种的名称。
2.2 培养基及试剂
培养基和细菌生化鉴定管，广东环凯微生物科技有限公司；沙门氏菌诊断血清(60种)，宁波天润生物药业有限公司；标准菌株，中国工业微生物菌种保藏管理中心；以上试剂均在有效期内。
2.3 主要仪器
电热恒温水浴锅(DZKW-D-4)，北京市永光明医疗仪器有限公司；生化培养箱(SPX-300BSH-II)，上海新苗医疗器械制造有限公司；厌氧培养箱(DG250)，英国DWS；显微镜(BX41)，奥林巴斯；全自动微生物生化鉴定仪(VITEK2)并配套革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌鉴定卡，法国梅里埃；以上所有仪器设备检定均在有限期内。
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2.4 检测方法
食品卫生微生物学检验标准GB 4789及CMA评审专家提供的《致病菌检测作业指导书》。
3 结果与分析
3.1 增菌培养
挑取质控样接种到脑心浸出液肉汤(BHI)培养基中，接种两瓶，分别放在生化培养箱和厌氧培养箱中以36℃培养24h，结果为两瓶增菌液均混浊。
3.2 划线分离
用接种环从增菌液中挑取1环直接划线接种到BS琼脂平板、XLD琼脂平板、沙门氏菌属显色琼脂平板、MAC琼脂平板、TCBS琼脂平板、血琼脂平板、Barid-Parker琼脂平板、哥伦比亚CNA血琼脂平板、MYP琼脂平板、PALCAM琼脂平板、李斯特氏菌显色琼脂平板、CT-SMAC琼脂平板、大肠埃希氏菌O157显色琼脂平板、阪崎肠杆菌显色琼脂平板、CN琼脂平板，观察菌落特征。在BS琼脂平板、XLD琼脂平板、沙门氏菌属显色琼脂平板、血琼脂平板和Barid-Parker琼脂平板中发现2种不同的可疑菌落，分别编为1号菌和2号菌，菌落特征见表1。
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3.3 生化试验[2]
挑取上述平板中的典型菌落接种到三糖铁琼脂斜面上，置36℃培养24h，观察生化特征并涂片染色，结果见表2。
1号菌继续做其它相关生化试验，结果符合沙门氏菌菌属，结果见表3。然后，经血清鉴定为鼠伤寒沙门氏菌(1，4，[5]，12：i：1，2)。
3.4 血浆凝固酶试验[3]
挑取Baird-Parker平板上的可疑菌落，接种到5mL BHI中，36℃±1℃培养18～24h。取新鲜配制兔血浆0.5mL，放入小试管中，再加入BHI培养物0.2～0.3mL，置于36℃±1℃培养，每半小时观察一次，观察6h，同时作阴性对照实验。结果发现，培养物小试管中呈现凝块，阴性对照未出现凝块，因此可判定结果为阳性，故2号菌可判定为金黄色葡萄球菌。
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3.5 全自动微生物生化鉴定
从营养琼脂平板上挑取可疑菌落，用生理盐水制备成0.5MCF浊度的菌悬液，1号菌和2号菌分别使用革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌鉴定卡，置于VITEK2全自动微生物鉴定系统进行分析，结果分别显示为沙门氏菌和金黄色葡萄球菌。
综合以上细菌菌落特征、菌体染色形态、生化试验、血清学和全自动生化鉴定结果，可判断该盲样样品中检出2种菌，即鼠伤寒沙门氏菌(1，4，[5]，12：i：1，2)和金黄色葡萄球菌。
4 结论与讨论
实验室在收到样品后，首先要对盲样样品状态进行确认，如出现包装破损或其他异常情况应及时与实施部门联系，这是做好质控盲样的前提[4]。准备检测前，应仔细阅读《作业指导书》，尽可能制定全面的检测方案。在分析鉴定过程中，应选择多种分离增菌液和选择性琼脂平板，并在选择性平板上尽可能挑取各种典型菌落[5]，以避免漏检。为做好混合菌种质控的鉴定分析工作，可采用常规生化试验与全自动微生物生化鉴定仪相结合的方式[6]，进而保证对菌种的结果判定更为准确、快捷。
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本次混合菌种鉴定项目取得了令人满意的实验结果。盲样考核是开展CMA/CNAS认证评审的重要内容，利用盲样测试进行现场评审能直接反映出实验室的仪器设备和技术素质的实际水平和出具报告的能力[7]，其不仅是衡量实验室技术能力的关键指标，还有利于检测机构重视检验水平的提升，不断提高专业技术人員的技能水平，确保检测结果的准确性。
参考文献：
[1] 凌秀梅，周浩，杨红，等.2015～2016年食源性致病菌能力验证结果分析[J].食品安全质量检测学报，2018，9(19)：5085-5089.
[2] GB 4789.4-2016 食品安全国家标准 食品微生物学检验 沙门氏菌检验[S].
[3] GB 4789.10-2016 食品安全国家标准 食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验[S].
[4] 李兰换，李剑英.一份混合菌种质控盲样的鉴定分析[J].中国煤炭工业医学杂志，2010，13(03)：374-375.
[5] 陈建琳，顾永洋.混合菌种盲样鉴定分析[J].应用预防医学，2012，18(05)：312-313.
[6] 卢艳玲，靳会娟，任艳平，等.实验室间混合菌种质控的鉴定分析[J].中国社区医师(医学专业)，2013，15(05)：261-262.
[7] 陆丽丽，夏捷，陶贤继，等.检测实验室盲样考核及其质量控制[J].环境科技，2011，24(S2)：76-78., http://www.100md.com(张春鹏)
关键词：微生物 盲样 鉴定 质控
1 引言
微生物盲样考核是对检测人员技能、实验室质量控制和管理水平的检验，实验室专业技术人员必须考虑实验室的设备、培养基、试剂、诊断血清等因素，从接种、培养、分离鉴定等环节进行严格的质量控制，减少主观因素对检验结果的影响，进而保证检验结果的准确性。在实验评审过程中，特别是现场评审中，盲样测试方式可以更直接地反映被评审实验室的仪器设备和技术素质的实际水平[1]。
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2 材料与方法
2.1 微生物盲样样品
样品为来自CMA评审专家提供的半固体1支，盲样编号为MY-WJ-01。盲样中有两种或以上菌株，且为食品检测中常见的致病菌，要求最终报告得出的结果是所有检出菌种的名称。
2.2 培养基及试剂
培养基和细菌生化鉴定管，广东环凯微生物科技有限公司；沙门氏菌诊断血清(60种)，宁波天润生物药业有限公司；标准菌株，中国工业微生物菌种保藏管理中心；以上试剂均在有效期内。
2.3 主要仪器
电热恒温水浴锅(DZKW-D-4)，北京市永光明医疗仪器有限公司；生化培养箱(SPX-300BSH-II)，上海新苗医疗器械制造有限公司；厌氧培养箱(DG250)，英国DWS；显微镜(BX41)，奥林巴斯；全自动微生物生化鉴定仪(VITEK2)并配套革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌鉴定卡，法国梅里埃；以上所有仪器设备检定均在有限期内。
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2.4 检测方法
食品卫生微生物学检验标准GB 4789及CMA评审专家提供的《致病菌检测作业指导书》。
3 结果与分析
3.1 增菌培养
挑取质控样接种到脑心浸出液肉汤(BHI)培养基中，接种两瓶，分别放在生化培养箱和厌氧培养箱中以36℃培养24h，结果为两瓶增菌液均混浊。
3.2 划线分离
用接种环从增菌液中挑取1环直接划线接种到BS琼脂平板、XLD琼脂平板、沙门氏菌属显色琼脂平板、MAC琼脂平板、TCBS琼脂平板、血琼脂平板、Barid-Parker琼脂平板、哥伦比亚CNA血琼脂平板、MYP琼脂平板、PALCAM琼脂平板、李斯特氏菌显色琼脂平板、CT-SMAC琼脂平板、大肠埃希氏菌O157显色琼脂平板、阪崎肠杆菌显色琼脂平板、CN琼脂平板，观察菌落特征。在BS琼脂平板、XLD琼脂平板、沙门氏菌属显色琼脂平板、血琼脂平板和Barid-Parker琼脂平板中发现2种不同的可疑菌落，分别编为1号菌和2号菌，菌落特征见表1。
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3.3 生化试验[2]
挑取上述平板中的典型菌落接种到三糖铁琼脂斜面上，置36℃培养24h，观察生化特征并涂片染色，结果见表2。
1号菌继续做其它相关生化试验，结果符合沙门氏菌菌属，结果见表3。然后，经血清鉴定为鼠伤寒沙门氏菌(1，4，[5]，12：i：1，2)。
3.4 血浆凝固酶试验[3]
挑取Baird-Parker平板上的可疑菌落，接种到5mL BHI中，36℃±1℃培养18～24h。取新鲜配制兔血浆0.5mL，放入小试管中，再加入BHI培养物0.2～0.3mL，置于36℃±1℃培养，每半小时观察一次，观察6h，同时作阴性对照实验。结果发现，培养物小试管中呈现凝块，阴性对照未出现凝块，因此可判定结果为阳性，故2号菌可判定为金黄色葡萄球菌。
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3.5 全自动微生物生化鉴定
从营养琼脂平板上挑取可疑菌落，用生理盐水制备成0.5MCF浊度的菌悬液，1号菌和2号菌分别使用革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌鉴定卡，置于VITEK2全自动微生物鉴定系统进行分析，结果分别显示为沙门氏菌和金黄色葡萄球菌。
综合以上细菌菌落特征、菌体染色形态、生化试验、血清学和全自动生化鉴定结果，可判断该盲样样品中检出2种菌，即鼠伤寒沙门氏菌(1，4，[5]，12：i：1，2)和金黄色葡萄球菌。
4 结论与讨论
实验室在收到样品后，首先要对盲样样品状态进行确认，如出现包装破损或其他异常情况应及时与实施部门联系，这是做好质控盲样的前提[4]。准备检测前，应仔细阅读《作业指导书》，尽可能制定全面的检测方案。在分析鉴定过程中，应选择多种分离增菌液和选择性琼脂平板，并在选择性平板上尽可能挑取各种典型菌落[5]，以避免漏检。为做好混合菌种质控的鉴定分析工作，可采用常规生化试验与全自动微生物生化鉴定仪相结合的方式[6]，进而保证对菌种的结果判定更为准确、快捷。
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本次混合菌种鉴定项目取得了令人满意的实验结果。盲样考核是开展CMA/CNAS认证评审的重要内容，利用盲样测试进行现场评审能直接反映出实验室的仪器设备和技术素质的实际水平和出具报告的能力[7]，其不仅是衡量实验室技术能力的关键指标，还有利于检测机构重视检验水平的提升，不断提高专业技术人員的技能水平，确保检测结果的准确性。
参考文献：
[1] 凌秀梅，周浩，杨红，等.2015～2016年食源性致病菌能力验证结果分析[J].食品安全质量检测学报，2018，9(19)：5085-5089.
[2] GB 4789.4-2016 食品安全国家标准 食品微生物学检验 沙门氏菌检验[S].
[3] GB 4789.10-2016 食品安全国家标准 食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验[S].
[4] 李兰换，李剑英.一份混合菌种质控盲样的鉴定分析[J].中国煤炭工业医学杂志，2010，13(03)：374-375.
[5] 陈建琳，顾永洋.混合菌种盲样鉴定分析[J].应用预防医学，2012，18(05)：312-313.
[6] 卢艳玲，靳会娟，任艳平，等.实验室间混合菌种质控的鉴定分析[J].中国社区医师(医学专业)，2013，15(05)：261-262.
[7] 陆丽丽，夏捷，陶贤继，等.检测实验室盲样考核及其质量控制[J].环境科技，2011，24(S2)：76-78., http://www.100md.com(张春鹏)