一起致泻性大肠埃希菌食物中毒的病原学检测分析(1)
摘 要：本文对一起疑似食物中毒事件中所采集的样本进行病原学检测分析，希望能够为预防食物中毒提供科学依据。应用全自动医用PCR分析系统对22种常见胃肠道感染相关病原体进行快速筛检，以实时荧光定量PCR技术进行毒力基因检测，并利用传统方法对病原菌进行分离培养。检测数据显示，35份样本的22种常见胃肠道感染相关病原体检测结果为检出致病性大肠埃希菌(EPEC);10份样本经实时荧光定量PCR技术检出EPEC毒力基因escV和内参基因uidA;经传统培养分离方法，最终从6份粪便样本中分离出目标菌EPEC。因此得出结论，综合流行病学调查、临床症状和实验室检验结果，推断出这是一起由携带EPEC的食堂工作人员通过污染食物导致学生感染发病的突发公共卫生事件。建议各级卫生监督部门加强对餐饮行业及其从业人员的监督检查力度，避免类似食物中毒事件的发生，进而保障人民的身体健康。
关键词：致泻性大肠埃希菌 食物中毒 实时荧光PCR 毒力基因
食源性疾病是指人体因摄食有毒有害物质(包括生物性病原体)等致病因子所引发的疾病，无论是在发达国家还是发展中国家其都是目前最为突出的公共卫生问题之一[1]。2020年6月，山东省淄博市某学校发生一起疑似食物中毒事件——6月29日～7月2日，该校陆续有30余人出现呕吐、恶心、腹痛、腹泻(多为水样便，3～6次/天)等消化系统症状。经流行病学调查发现，发病患者均曾在该校食堂就餐，共同暴露食品为西红柿炒鸡蛋、炸虾、稀饭等，除一名患者为食堂内部工作人员外，其余均为学生，且共同进餐人数约200人。本实验采用全自动医用PCR分析系统对采集样本混合样进行22种常见胃肠道感染相关病原体快速诊断，结果判定为致泻大肠埃希菌，然后利用实时荧光PCR技术对所有样本进行致泻大肠埃希菌初筛检验，同时进行样本中致泻大肠埃希菌的增菌培养、分离鉴定。结果证实，导致本次食物中毒事件的病原体是携带毒力基因escV和内参基因uidA的EPEC。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株及标本来源
本次事件共采集样本35份，其中，患者粪便23份、肛拭子7份、可疑食物3份(炸虾、肉夹馍、西红柿炒鸡蛋)、熟食刀和熟食砧板涂抹物各1份。将被采集样本装入无菌采样容器后进行编号，然后立即送至市疾控实验室进行病原微生物检验。质控菌株为聚集性大肠埃希菌(EAEC)CMCC24186、产毒性大肠埃希菌(ETEC)CMCC10667、致病性大肠埃细菌(EPEC)CMCC24189、侵袭性大肠埃希菌(EIEC)CMCC10662、出血性大肠埃希菌(EHEC)CMCC24187，均由山东省疾病预防控制中心提供。
1.1.2 主要仪器
FilmArray全自动医用PCR分析系统，法国梅里埃诊断产品(上海)有限公司;ABI QuantStudio 5实时荧光PCR仪，美国ABI公司。
1.1.3 主要试剂
胃肠道感染检测试条(FilmArray G1 Panel)，法国梅里埃诊断产品(上海)有限公司;5种致泻性大肠杆菌核酸检测预分装试剂盒(荧光PCR法)，深圳生科原生物股份有限公司;营养肉汤、EE肉汤、麦康凯琼脂培养基、脑心浸液琼脂培养基等，北京陆桥有限公司，以上试剂均在有效期内使用。
1.2 方法
1.2.1 全自动医用PCR分析检测
按照胃肠道感染检测试条(FilmArray G1 Panel)操作说明对被采集样本混合样预处理后，进行22种常见胃肠道感染相关病原体的快速诊断。
1.2.2 实时荧光定量PCR检测
按照5种致泻性大肠杆菌核酸检测预分装试剂盒(荧光PCR法)操作说明，应用ABI QuantStudio 5实时荧光PCR仪对35份样本进行5种致泻大肠埃希菌12种特异性基因检测。
1.2.3 致泻性大肠埃希菌的分离培养
依据《食品安全国家标准 食品卫生微生物学检验 致泻大肠埃希氏菌检验》(GB/T 4789.6-2016)和《山东省食源性疾病主动监测工作手册》(2020年版)，对所采集样本进行致泻大肠埃希菌的增菌、分离和鉴定(肛拭子和粪便不增菌，直接进行分离和鉴定)。
2 结果
2.1 全自动医用PCR分析系统检测结果
使用全自动医用PCR分析系统对所有样本的混合样进行22种常见胃肠道感染相关病原体检测，结果为检出致泻大肠埃希菌，具体型别为致病性大肠埃希菌(EPEC)，详见表1。
2.2 实时荧光定量PCR检测结果
选择FAM、HEX/VIC/JOE、ROX、CY5這4个荧光通道分别对A/B/C管反应液进行荧光采集(见表2)，记录Ct值。样本检测结果判定：Ct值≤35，有明显指数增长，为阳性;Ct值在35～38范围，需对其重复检测，如重复实验结果Ct值仍在35～38范围，且有明显指数增长，则判定为阳性，否则为阴性;Ct值>38或无Ct值，判定为阴性。参照表3对35份样本的Ct值进行判读，最终判定结果为10份样本(2份肛拭子、8份粪便)初筛EPEC阳性，见表4。
2.3 致泻性大肠埃希菌的分离培养
依据全自动医用PCR分析检测结果和实时荧光定量PCR初筛检测结果，明确引起本次疑似食物中毒事件的病原菌为EPEC。对采集样本进行增菌培养后(肛拭子和粪便不增菌，直接进行分离和鉴定)，划线至麦康凯琼脂培养基继续培养24h，挑取玫红色可疑菌落划线至脑心浸液琼脂培养基，培养得到菌株纯培养物。然后，再次应用实时荧光PCR技术对获得的菌株纯培养物进行5种致泻性大肠埃希菌的12种特异性基因复核鉴定，最终从6份粪便标本中分离出携带毒力基因escV和内参基因uidA的EPEC菌株。, 百拇医药(王银平 吴莹 刘军 张群)
关键词：致泻性大肠埃希菌 食物中毒 实时荧光PCR 毒力基因
食源性疾病是指人体因摄食有毒有害物质(包括生物性病原体)等致病因子所引发的疾病，无论是在发达国家还是发展中国家其都是目前最为突出的公共卫生问题之一[1]。2020年6月，山东省淄博市某学校发生一起疑似食物中毒事件——6月29日～7月2日，该校陆续有30余人出现呕吐、恶心、腹痛、腹泻(多为水样便，3～6次/天)等消化系统症状。经流行病学调查发现，发病患者均曾在该校食堂就餐，共同暴露食品为西红柿炒鸡蛋、炸虾、稀饭等，除一名患者为食堂内部工作人员外，其余均为学生，且共同进餐人数约200人。本实验采用全自动医用PCR分析系统对采集样本混合样进行22种常见胃肠道感染相关病原体快速诊断，结果判定为致泻大肠埃希菌，然后利用实时荧光PCR技术对所有样本进行致泻大肠埃希菌初筛检验，同时进行样本中致泻大肠埃希菌的增菌培养、分离鉴定。结果证实，导致本次食物中毒事件的病原体是携带毒力基因escV和内参基因uidA的EPEC。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株及标本来源
本次事件共采集样本35份，其中，患者粪便23份、肛拭子7份、可疑食物3份(炸虾、肉夹馍、西红柿炒鸡蛋)、熟食刀和熟食砧板涂抹物各1份。将被采集样本装入无菌采样容器后进行编号，然后立即送至市疾控实验室进行病原微生物检验。质控菌株为聚集性大肠埃希菌(EAEC)CMCC24186、产毒性大肠埃希菌(ETEC)CMCC10667、致病性大肠埃细菌(EPEC)CMCC24189、侵袭性大肠埃希菌(EIEC)CMCC10662、出血性大肠埃希菌(EHEC)CMCC24187，均由山东省疾病预防控制中心提供。
1.1.2 主要仪器
FilmArray全自动医用PCR分析系统，法国梅里埃诊断产品(上海)有限公司;ABI QuantStudio 5实时荧光PCR仪，美国ABI公司。
1.1.3 主要试剂
胃肠道感染检测试条(FilmArray G1 Panel)，法国梅里埃诊断产品(上海)有限公司;5种致泻性大肠杆菌核酸检测预分装试剂盒(荧光PCR法)，深圳生科原生物股份有限公司;营养肉汤、EE肉汤、麦康凯琼脂培养基、脑心浸液琼脂培养基等，北京陆桥有限公司，以上试剂均在有效期内使用。
1.2 方法
1.2.1 全自动医用PCR分析检测
按照胃肠道感染检测试条(FilmArray G1 Panel)操作说明对被采集样本混合样预处理后，进行22种常见胃肠道感染相关病原体的快速诊断。
1.2.2 实时荧光定量PCR检测
按照5种致泻性大肠杆菌核酸检测预分装试剂盒(荧光PCR法)操作说明，应用ABI QuantStudio 5实时荧光PCR仪对35份样本进行5种致泻大肠埃希菌12种特异性基因检测。
1.2.3 致泻性大肠埃希菌的分离培养
依据《食品安全国家标准 食品卫生微生物学检验 致泻大肠埃希氏菌检验》(GB/T 4789.6-2016)和《山东省食源性疾病主动监测工作手册》(2020年版)，对所采集样本进行致泻大肠埃希菌的增菌、分离和鉴定(肛拭子和粪便不增菌，直接进行分离和鉴定)。
2 结果
2.1 全自动医用PCR分析系统检测结果
使用全自动医用PCR分析系统对所有样本的混合样进行22种常见胃肠道感染相关病原体检测，结果为检出致泻大肠埃希菌，具体型别为致病性大肠埃希菌(EPEC)，详见表1。
2.2 实时荧光定量PCR检测结果
选择FAM、HEX/VIC/JOE、ROX、CY5這4个荧光通道分别对A/B/C管反应液进行荧光采集(见表2)，记录Ct值。样本检测结果判定：Ct值≤35，有明显指数增长，为阳性;Ct值在35～38范围，需对其重复检测，如重复实验结果Ct值仍在35～38范围，且有明显指数增长，则判定为阳性，否则为阴性;Ct值>38或无Ct值，判定为阴性。参照表3对35份样本的Ct值进行判读，最终判定结果为10份样本(2份肛拭子、8份粪便)初筛EPEC阳性，见表4。
2.3 致泻性大肠埃希菌的分离培养
依据全自动医用PCR分析检测结果和实时荧光定量PCR初筛检测结果，明确引起本次疑似食物中毒事件的病原菌为EPEC。对采集样本进行增菌培养后(肛拭子和粪便不增菌，直接进行分离和鉴定)，划线至麦康凯琼脂培养基继续培养24h，挑取玫红色可疑菌落划线至脑心浸液琼脂培养基，培养得到菌株纯培养物。然后，再次应用实时荧光PCR技术对获得的菌株纯培养物进行5种致泻性大肠埃希菌的12种特异性基因复核鉴定，最终从6份粪便标本中分离出携带毒力基因escV和内参基因uidA的EPEC菌株。, 百拇医药(王银平 吴莹 刘军 张群)