2.2.3 western blot法測定MMP-9、TIMP-1蛋白表达 取出血管组织，剔除外膜结缔组织，尽量剪碎，加入1 mL的RIPA裂解液，2 μL PMSF，研磨至无明显的组织碎片，再置于冰上0.5 h后，将组织匀浆液移至1.5 mL的离心管中，于4 ℃ 10 000 r/min离心10 min，取上清液。以BCA法测定样品的蛋白含量。按配方制备10%聚丙烯酰胺分离胶和5%聚丙烯酰胺浓缩胶，将凝胶转移至电泳槽。取样品蛋白，加入2×SDS loading buffer、β-巯基乙醇、裂解液调整蛋白浓度(1 μg/μL)，置沸水中煮10 min使蛋白变性。将待分析样品和Marker依次加入，每个泳道加入20 μL。然后进行电泳。电泳完毕后，将凝胶放在电转液中，恒流20 mA转膜，4 ℃冰箱中过夜，使凝胶目的蛋白转移至PVDF膜上。将PVDF膜用PBS液洗2次，然后放入5%PBS-脱脂奶粉封闭液内封闭90 min。将PVDF膜放入杂交袋中，加入约1 mL一抗(MMP-9 1∶1 000， TIMP-l l∶1 000， β-actin 1∶1 000)，在室温下摇床(70 r/min)孵育90 min。PBS洗3次，每次10 min ......