活血散结方含药血浆对视网膜色素上皮细胞毒性作用的研究(1)
〔摘要〕 目的 制备活血散结方含药血浆，并研究其不同浓度对视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)细胞的毒性作用。方法 以成年健康家兔为对象，制备活血散结方含药血浆。将提取的兔原代RPE细胞分9个组，分别为：空白对照组、正常血浆组、5%含药血浆组、10%含药血浆组、20%含药血浆组、40%含药血浆组、60%含药血浆组、80%含药血浆组、100%含药血浆组，予以相对应浓度的含药血浆干预，CCK8法检测含药血浆对兔RPE细胞毒作用。结果 活血散结方各浓度含药血浆对RPE细胞有抑制作用，其中5%～20%含药血浆对RPE细胞有较弱的抑制作用，但与正常血浆比较，抑制率差异无统计学意义(P>0.05);而40%～100%含药血浆对RPE细胞生长有明显的抑制作用，与正常血浆比较，抑制率差异有统计学意义(P<0.05)。结论 活血散结方含药血浆对RPE细胞有一定的抑制作用，抑制程度与含药血浆浓度成量效关系，可以考虑选择5%～20%含药血浆浓度作为后续实验研究的干预浓度。
〔关键词〕 活血散结方;视网膜色素上皮细胞;细胞毒性;含药血浆
〔中图分类号〕R285.5;R276.7 〔文献标志码〕A 〔文章编号〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2019.02.003
增生性玻璃体视网膜病变(proiiferative vitreoretinopathy，PVR)是孔源性视网膜脱离、糖尿病视网膜病变、玻璃体出血以及眼球后段穿通伤等眼底疾病的严重并发症，目前该病的发病率在逐年增加[1-3]。PVR的基本病理生理过程主要涉及细胞增生、细胞外基质(extracellular matrix， ECM)的合成和膜的收缩[4]。视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)细胞在PVR的发生和发展过程中起关键作用，是重要的介导细胞，也是目前建立PVR模型的主要细胞[5]。目前许多学者提出使用药物预防PVR的发展，主要目的在于抗增殖及炎症[6]，而这些药物例如秋水仙碱、5-氟尿嘧啶、地塞米松等，或处于实验临床阶段，或因其药物毒性、长期并发症等原因，真正应用于临床的很少，故尚无作为防治PVR的临床常规药物[7]。近年来，许多报道中药及其制剂防治PVR己取得不错疗效[8-12]。湖南中医药大学彭清华教授从中医学对PVR的认识及多年来的临床经验出发，在眼科水血同治的原则和基础上，提出活血散结方，已取得良好的疗效。本文将探讨不同浓度活血散结方含药血浆对兔RPE细胞活性的影响。
1 材料
1.1 实验动物
成年健康无眼疾青紫蓝兔4只，雌雄不限，体质量1.5～2.0 kg，由上海市松江区车墩实验动物良种场提供，动物许可证号：SXCK(沪)2012-0008。實验前行常规眼科检查(裂隙灯、间接眼底镜)，排除眼内外疾患方进入实验。含药血浆制备：成年健康家兔8只，雌雄兼用，体质量1.5～2.0 kg，由湖南中医药大学动物实验中心提供，动物许可证号：SYXK(湘)2015-0004。常规喂养，控制室温20～26 ℃，保持空气流通，相对湿度55%左右，实验前所有动物适应性饲养1周。
1.2 药物制备
活血散结方：由三七、丹参、海藻、昆布、鳖甲、地龙配伍组成，饮片由湖南中医药大第一附属医院药剂科提供。采用水煎法，分煎2次后混合药液浓缩至1.025 g/mL生药浓度，4 ℃以下保存。
1.3 试剂及仪器
1640培养基(美国Hyclone公司);胎牛血清(FBS，杭州四季青公司);胰蛋白酶(美国GIBCO公司);D-Hank液(美国GIBCO公司);聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X 100，上海索莱宝公司);荧光封片剂(Fluoromount-G，上海索莱宝公司);小鼠抗兔广谱细胞角蛋白(南京vazyme公司);羊抗兔Alexa Fluor 488(南京vazyme公司);细胞增殖与毒性检测试剂盒(七海生物公司)。CO2细胞培养箱(美国Thermo公司3111);倒置显微镜(德国Motic公司 AE31);酶标仪(美国Bio-tek公司ELX800)。
2 方法
2.1 活血散结方含药血浆的制备
采用随机数字法将家兔分为活血散结方组、空白组，每组4只。根据人与家兔体表面积换算方法计算(人以60 kg体质量为标准，家兔以1.6 kg体质量为标准)，按等效剂量换算法换算家兔活血散结方组的等效临床剂量为20.256 g/kg≈20.3 g/kg。空白组灌服蒸馏水，均为每日20 mL/kg灌胃，分早晚两次灌服，连续灌胃5 d。采血前禁食禁水12 h，末次给药2 h后，无菌条件下腹主动脉取血，收集血液于含3.2%枸缘酸钠1∶9真空采血管内，颠倒混匀后静置。在3 000 r/min条件下离心10 min，收集上清液即为含药血浆。0.22 μm膜滤过分装，置于-70 ℃超低温冰箱保存。
2.2 兔原代RPE细胞的培养
采用酶消化法获取兔原代RPE细胞[13]。取青紫蓝兔耳缘静脉处空气栓塞法处死，无菌操作条件下摘除眼球，去净眼球表面筋膜，生理盐水充分冲洗，巩膜穿刺刀沿锯齿缘后2 mm处刺入，用显微剪环形剪开眼球前段，去除角膜、晶状体以及玻璃体，由视网膜周边至视乳头方向轻轻去除视网膜神经上皮层。将眼杯置于眼球托上，7-0线在四个方向缝合固定眼杯，PBS冲洗。滴加胰蛋白酶，放置细菌培养箱中消化30 min，加入含10%胎牛血清的培养基终止反应。用吸管轻轻吹打眼球内壁使RPE细胞脱落分散，收集眼杯中细胞悬液于离心管中。胰酶消化，离心，弃去上清液，加入10%胎牛培养基将细胞吹打分散，将RPE细胞调整为4×104～5×104个/mL细胞的密度，并接种于25 mL培养瓶，在37 ℃、5%CO2和相对湿度90%的培养箱中培养。细胞贴壁后每3天更换培养液，直到细胞融合。当细胞贴壁铺满大部分瓶底即可进行传代培养。, 百拇医药(潘坤 彭俊 吴佳敏 张又玮 李建超 吴权龙 彭清华)
〔关键词〕 活血散结方;视网膜色素上皮细胞;细胞毒性;含药血浆
〔中图分类号〕R285.5;R276.7 〔文献标志码〕A 〔文章编号〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2019.02.003
增生性玻璃体视网膜病变(proiiferative vitreoretinopathy，PVR)是孔源性视网膜脱离、糖尿病视网膜病变、玻璃体出血以及眼球后段穿通伤等眼底疾病的严重并发症，目前该病的发病率在逐年增加[1-3]。PVR的基本病理生理过程主要涉及细胞增生、细胞外基质(extracellular matrix， ECM)的合成和膜的收缩[4]。视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)细胞在PVR的发生和发展过程中起关键作用，是重要的介导细胞，也是目前建立PVR模型的主要细胞[5]。目前许多学者提出使用药物预防PVR的发展，主要目的在于抗增殖及炎症[6]，而这些药物例如秋水仙碱、5-氟尿嘧啶、地塞米松等，或处于实验临床阶段，或因其药物毒性、长期并发症等原因，真正应用于临床的很少，故尚无作为防治PVR的临床常规药物[7]。近年来，许多报道中药及其制剂防治PVR己取得不错疗效[8-12]。湖南中医药大学彭清华教授从中医学对PVR的认识及多年来的临床经验出发，在眼科水血同治的原则和基础上，提出活血散结方，已取得良好的疗效。本文将探讨不同浓度活血散结方含药血浆对兔RPE细胞活性的影响。
1 材料
1.1 实验动物
成年健康无眼疾青紫蓝兔4只，雌雄不限，体质量1.5～2.0 kg，由上海市松江区车墩实验动物良种场提供，动物许可证号：SXCK(沪)2012-0008。實验前行常规眼科检查(裂隙灯、间接眼底镜)，排除眼内外疾患方进入实验。含药血浆制备：成年健康家兔8只，雌雄兼用，体质量1.5～2.0 kg，由湖南中医药大学动物实验中心提供，动物许可证号：SYXK(湘)2015-0004。常规喂养，控制室温20～26 ℃，保持空气流通，相对湿度55%左右，实验前所有动物适应性饲养1周。
1.2 药物制备
活血散结方：由三七、丹参、海藻、昆布、鳖甲、地龙配伍组成，饮片由湖南中医药大第一附属医院药剂科提供。采用水煎法，分煎2次后混合药液浓缩至1.025 g/mL生药浓度，4 ℃以下保存。
1.3 试剂及仪器
1640培养基(美国Hyclone公司);胎牛血清(FBS，杭州四季青公司);胰蛋白酶(美国GIBCO公司);D-Hank液(美国GIBCO公司);聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X 100，上海索莱宝公司);荧光封片剂(Fluoromount-G，上海索莱宝公司);小鼠抗兔广谱细胞角蛋白(南京vazyme公司);羊抗兔Alexa Fluor 488(南京vazyme公司);细胞增殖与毒性检测试剂盒(七海生物公司)。CO2细胞培养箱(美国Thermo公司3111);倒置显微镜(德国Motic公司 AE31);酶标仪(美国Bio-tek公司ELX800)。
2 方法
2.1 活血散结方含药血浆的制备
采用随机数字法将家兔分为活血散结方组、空白组，每组4只。根据人与家兔体表面积换算方法计算(人以60 kg体质量为标准，家兔以1.6 kg体质量为标准)，按等效剂量换算法换算家兔活血散结方组的等效临床剂量为20.256 g/kg≈20.3 g/kg。空白组灌服蒸馏水，均为每日20 mL/kg灌胃，分早晚两次灌服，连续灌胃5 d。采血前禁食禁水12 h，末次给药2 h后，无菌条件下腹主动脉取血，收集血液于含3.2%枸缘酸钠1∶9真空采血管内，颠倒混匀后静置。在3 000 r/min条件下离心10 min，收集上清液即为含药血浆。0.22 μm膜滤过分装，置于-70 ℃超低温冰箱保存。
2.2 兔原代RPE细胞的培养
采用酶消化法获取兔原代RPE细胞[13]。取青紫蓝兔耳缘静脉处空气栓塞法处死，无菌操作条件下摘除眼球，去净眼球表面筋膜，生理盐水充分冲洗，巩膜穿刺刀沿锯齿缘后2 mm处刺入，用显微剪环形剪开眼球前段，去除角膜、晶状体以及玻璃体，由视网膜周边至视乳头方向轻轻去除视网膜神经上皮层。将眼杯置于眼球托上，7-0线在四个方向缝合固定眼杯，PBS冲洗。滴加胰蛋白酶，放置细菌培养箱中消化30 min，加入含10%胎牛血清的培养基终止反应。用吸管轻轻吹打眼球内壁使RPE细胞脱落分散，收集眼杯中细胞悬液于离心管中。胰酶消化，离心，弃去上清液，加入10%胎牛培养基将细胞吹打分散，将RPE细胞调整为4×104～5×104个/mL细胞的密度，并接种于25 mL培养瓶，在37 ℃、5%CO2和相对湿度90%的培养箱中培养。细胞贴壁后每3天更换培养液，直到细胞融合。当细胞贴壁铺满大部分瓶底即可进行传代培养。, 百拇医药(潘坤 彭俊 吴佳敏 张又玮 李建超 吴权龙 彭清华)