骨髓间充质干细胞治疗EAE的实验研究
[摘要] 目的 探讨骨髓间充质干细胞(BMSCs)移植对实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)小鼠的治疗效果。方法 MOG35-55免疫C57BL/6小鼠制备EAE模型、BMSCs进行ELISA法检测各组淋巴细胞培养上清液中细胞因子INF-γ、IL-17、IL-10的水平。结果 BMSCs能够显著抑制INF-γ和IL-17的分泌(P<0.05)，促进IL-10 的分泌(P<0.05)。结论 BMSCs 能有效抑制小鼠EAE。
[关键词] 骨髓间充质干细胞；自身免疫性脑脊髓炎；INF-γ；IL-17，IL-10
[中图分类号] R681.8 [文献标识码] A [文章编号] 1674-0742(2012)09(c)-0035-02
实验性自身免疫性脑脊髓炎( Experimental Autoimmune Encephalomyelitis, EAE)是髓鞘特异性T淋巴细胞介导的自身免疫性疾病,是目前国际上公认的研究多发性硬化的理想模型。骨髓间充质干细胞( Bone Mesenchymal Stem Cells, BMSCs)是一种具有多向分化潜能的种子细胞，在一定条件下可以分化为神经元和神经胶质细胞[1]。本研究应用C57BL/6 雌性小鼠建立EAE模型，通过同种异体BMSCs移植，观察EAE小鼠淋巴细胞分泌细胞因子的情况，探讨BMSCs对EAE小鼠的治疗作用，为MS的临床治疗提供理论依据。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 C57BL/6小鼠MSCs的分离、扩增培养
参照Pittenger等[2]描述的方法,分离培养小鼠BMSCs。取C578BL/6的股骨、胫骨等长骨骨髓，采用骨髓培养法，按1×106/mL的密度接种至含10%胎牛血清(FBS)的高糖DMEM培养基中，5% CO2箱中孵育48 h后换液，3 d/次，细胞贴壁生长呈纤维样，1∶3传代继续扩增培养。
1. 2 EAE动物模型制备
参照我们之前的实验方法制作EAE模型[3]。将C57BL/6雌性小鼠分为EAE组、BMSCs治疗组和佐剂组，用MOG35-55诱导EAE模型，佐剂组以等量生理 盐水代替。BMSCs治疗组在发病第1天注射体外培养的BMSCs(1×106个)移植到EAE小鼠体内。
, 百拇医药
1.3 脾细胞的分离和制备
动物于p.i.18 d,各组取出8只小鼠,制备脾脏淋巴细胞悬液[3]。
1.4 细胞因子检测
参照ELISA试剂盒的说明书检测培淋巴上清液中细胞因子INF-γ、IL-17和IL-10的含量，测定A450 值。
1.5 统计方法
数据均用(x±s)来表示，采用SPSS 13.0 软件对所得数据进行分析处理，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 小鼠MSCs的原代和传代培养
分离的骨髓细胞培养24 h后可见散在贴壁细胞，72 h后细胞开始增殖，呈集落样生长，细胞体积较小。传代细胞不再呈集落样生长，而是散在分布, 细胞较原代细胞大，呈宽大扁平状。
, 百拇医药
2.2 脾淋巴细胞上清液中细胞因子的检测结果
对各组淋巴细胞分泌的细胞因子INF-γ、IL-17和IL-10进行检测，发现EAE组三种细胞因子INF-γ、IL-17、IL-10的分泌均有增加，BMSCs明显抑制INF-γ、IL-17的分泌，并且促进IL-10 的分泌。
3 讨论
EAE是CD4+T细胞介导的自身免疫性疾病, 细胞因子的生成和调节是CD4+T细胞发挥效应作用的主要机制。Th1细胞主要分泌INF-γ、TNF-α等细胞因子，使EAE加重 ；Th2细胞则主要分泌IL-10和IL-4等细胞因子；对EAE有抑制作用[3]。MS病人血脑屏障细胞表达IL-17 和IL-23受体并且诱导BBB内皮细胞表达ACL2，ACL2与Th17细胞表面相应的趋化因子CCR2 受体结合后，破坏紧密连接，有效地通过BBB进入CNS，引起 CNS炎性改变[4]。IL-10是一种免疫负调节因子, 可以抑制Th1细胞分泌INF-γ、IL-2等因子,在EAE中具有抑制免疫病理的作用[5]。
, 百拇医药
我们发现在EAE发病高峰期,细胞因子INF-γ和IL-17显著上升。BMSCs移植治疗组显著抑制了INF-γ和IL-17，而提高了IL-10的分泌。推测BMSCs可能抑制Th1类细胞因子的分泌, 促进Th2类细胞因子的释放, 诱导Th1/Th2向Th2方向偏移。因此推测BMSCs治疗EAE的可能机制是抑制了炎症反应，从而达到保护轴突的作用，这为临床治疗MS提供了理论依据。
[参考文献]
[1] Woodbury D, Schw arz EJ, Prockop DJ, et al. Adult rat and human bone marrow stromal ce ls differentiate into neurons[J]. J Neurosci Res , 2000, 61(4) : 364-370.
[2] Pittenger MF, Mackay AM, Beck SC, et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells [J]. Science. 1999, 284(5411): 143-147.
, http://www.100md.com
[3] 段惠洁，郭敏芳 ，尉杰忠，等。盐酸法舒地尔抑制小鼠EAE作用及机制研究[J].山西大同大学学报。2010,26(4)：53-57
[4] Kebir H, Kreymborg K, Ifergan I, et al. Human TH17 lymphocytes promote blood-brain barrier disruption and central nervous system inflammation[J].Nat Med.2007,13(10):1173-1175.
[5] Mekala DJ, Alli RS, Geiger TL. IL-10-dependent suppression of experimental allergic encephalomyelitis by Th2-differentiated, anti-TCR redirected T lymphocytes[J]. J Immunol, 2005, 174( 6): 3789-3797.
(收稿日期：2012-5-11), 百拇医药(刘华 刘颖 丰玲 王雁春 穆秉桃 王英慧 郭敏芳)
[关键词] 骨髓间充质干细胞；自身免疫性脑脊髓炎；INF-γ；IL-17，IL-10
[中图分类号] R681.8 [文献标识码] A [文章编号] 1674-0742(2012)09(c)-0035-02
实验性自身免疫性脑脊髓炎( Experimental Autoimmune Encephalomyelitis, EAE)是髓鞘特异性T淋巴细胞介导的自身免疫性疾病,是目前国际上公认的研究多发性硬化的理想模型。骨髓间充质干细胞( Bone Mesenchymal Stem Cells, BMSCs)是一种具有多向分化潜能的种子细胞，在一定条件下可以分化为神经元和神经胶质细胞[1]。本研究应用C57BL/6 雌性小鼠建立EAE模型，通过同种异体BMSCs移植，观察EAE小鼠淋巴细胞分泌细胞因子的情况，探讨BMSCs对EAE小鼠的治疗作用，为MS的临床治疗提供理论依据。
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1 材料与方法
1.1 C57BL/6小鼠MSCs的分离、扩增培养
参照Pittenger等[2]描述的方法,分离培养小鼠BMSCs。取C578BL/6的股骨、胫骨等长骨骨髓，采用骨髓培养法，按1×106/mL的密度接种至含10%胎牛血清(FBS)的高糖DMEM培养基中，5% CO2箱中孵育48 h后换液，3 d/次，细胞贴壁生长呈纤维样，1∶3传代继续扩增培养。
1. 2 EAE动物模型制备
参照我们之前的实验方法制作EAE模型[3]。将C57BL/6雌性小鼠分为EAE组、BMSCs治疗组和佐剂组，用MOG35-55诱导EAE模型，佐剂组以等量生理 盐水代替。BMSCs治疗组在发病第1天注射体外培养的BMSCs(1×106个)移植到EAE小鼠体内。
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1.3 脾细胞的分离和制备
动物于p.i.18 d,各组取出8只小鼠,制备脾脏淋巴细胞悬液[3]。
1.4 细胞因子检测
参照ELISA试剂盒的说明书检测培淋巴上清液中细胞因子INF-γ、IL-17和IL-10的含量，测定A450 值。
1.5 统计方法
数据均用(x±s)来表示，采用SPSS 13.0 软件对所得数据进行分析处理，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 小鼠MSCs的原代和传代培养
分离的骨髓细胞培养24 h后可见散在贴壁细胞，72 h后细胞开始增殖，呈集落样生长，细胞体积较小。传代细胞不再呈集落样生长，而是散在分布, 细胞较原代细胞大，呈宽大扁平状。
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2.2 脾淋巴细胞上清液中细胞因子的检测结果
对各组淋巴细胞分泌的细胞因子INF-γ、IL-17和IL-10进行检测，发现EAE组三种细胞因子INF-γ、IL-17、IL-10的分泌均有增加，BMSCs明显抑制INF-γ、IL-17的分泌，并且促进IL-10 的分泌。
3 讨论
EAE是CD4+T细胞介导的自身免疫性疾病, 细胞因子的生成和调节是CD4+T细胞发挥效应作用的主要机制。Th1细胞主要分泌INF-γ、TNF-α等细胞因子，使EAE加重 ；Th2细胞则主要分泌IL-10和IL-4等细胞因子；对EAE有抑制作用[3]。MS病人血脑屏障细胞表达IL-17 和IL-23受体并且诱导BBB内皮细胞表达ACL2，ACL2与Th17细胞表面相应的趋化因子CCR2 受体结合后，破坏紧密连接，有效地通过BBB进入CNS，引起 CNS炎性改变[4]。IL-10是一种免疫负调节因子, 可以抑制Th1细胞分泌INF-γ、IL-2等因子,在EAE中具有抑制免疫病理的作用[5]。
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我们发现在EAE发病高峰期,细胞因子INF-γ和IL-17显著上升。BMSCs移植治疗组显著抑制了INF-γ和IL-17，而提高了IL-10的分泌。推测BMSCs可能抑制Th1类细胞因子的分泌, 促进Th2类细胞因子的释放, 诱导Th1/Th2向Th2方向偏移。因此推测BMSCs治疗EAE的可能机制是抑制了炎症反应，从而达到保护轴突的作用，这为临床治疗MS提供了理论依据。
[参考文献]
[1] Woodbury D, Schw arz EJ, Prockop DJ, et al. Adult rat and human bone marrow stromal ce ls differentiate into neurons[J]. J Neurosci Res , 2000, 61(4) : 364-370.
[2] Pittenger MF, Mackay AM, Beck SC, et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells [J]. Science. 1999, 284(5411): 143-147.
, http://www.100md.com
[3] 段惠洁，郭敏芳 ，尉杰忠，等。盐酸法舒地尔抑制小鼠EAE作用及机制研究[J].山西大同大学学报。2010,26(4)：53-57
[4] Kebir H, Kreymborg K, Ifergan I, et al. Human TH17 lymphocytes promote blood-brain barrier disruption and central nervous system inflammation[J].Nat Med.2007,13(10):1173-1175.
[5] Mekala DJ, Alli RS, Geiger TL. IL-10-dependent suppression of experimental allergic encephalomyelitis by Th2-differentiated, anti-TCR redirected T lymphocytes[J]. J Immunol, 2005, 174( 6): 3789-3797.
(收稿日期：2012-5-11), 百拇医药(刘华 刘颖 丰玲 王雁春 穆秉桃 王英慧 郭敏芳)
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