整合素αvβ3拮抗剂SB—273005对C6胶质瘤细胞talin、survivin蛋白表达及磷酸化的影响(1)
[摘要] 目的 检测整合素αvβ3拮抗剂SB-273005对C6神经胶质瘤细胞talin、survivin蛋白表达量及其磷酸化的影响。方法将C6细胞常规培养后，分对照组(0 mg/L)、SB-273005低浓度组(25 mg/L)和SB-273005高浓度组(50 mg/L)3组，采用western法检测不同浓度的SB-273005对C6细胞踝蛋白(talin)、生存素蛋白(survivin)表达量以及其磷酸化的变化，并检测各组蛋白条带光密度变化。 结果 不同浓度的SB-273005均能明显降低C6细胞talin、survivin蛋白的表达，对二者的磷酸化有明显的抑制作用。测得对照组、SB-273005低浓度组和SB-273005高浓度组蛋白条带光密度，得出talin/β-actin比值分别为0.76、0.43、0.26(*P<0.05)；磷酸化的talin/β-actin比值分别为0.82、0.33、0.15(*P<0.05)。survivin/β-actin比值分别为0.84、0.21、0.09.(*P<0.05)，磷酸化的survivin/β-actin比值分别为0.19、0.04、0.01(*P<0.05)。3组相比，差异有统计学意义。结论 SB-273005对大鼠C6神经胶质瘤细胞talin、survivin蛋白表达量及其磷酸化起负性调节作用。
, http://www.100md.com
[关键词] C6神经胶质瘤细胞；踝蛋白；生存素； SB-273005
[中图分类号] R3 [文献标识码] A [文章编号] 1674-0742(2014)12(a)-0044-02
目前研究发现，在胶质瘤细胞中，talin、survivin所能发挥的生物学作用与整合素αvβ3的活性状态密切相关[1]。talin与survivin蛋白的磷酸化水平与胶质瘤恶性程度存在关联性，胶质瘤的恶性程度越高，二者的磷酸化水平随之增高[2]。因此，该实验2013年12月—2014年6月间通过采用整合素αvβ3拮抗剂SB-273005，抑制整合素活性，观察整合素αvβ3的活性改变后与talin、survivin的表达量及其磷酸化是否存在相关性，并探讨其作用机制，以期为脑胶质瘤的治疗寻求更有效的方法，报道如下。
1 材料与方法
1.1 材料
, http://www.100md.com
实验自2013年12月开始，2014年6月结束。C6神经胶质瘤细胞由南方医科大学神经外科实验室提供；整合素αvβ3拮抗剂SB-273005为Dupont公司产品；抗talin抗体、survivin抗体、survivin磷酸化单克隆抗体购于武汉博士德生物公司； DMEM培养基、FBS、RIPA缓冲液、TBST液、HRP-羊抗兔LgG、Rabbit Anti-β-Actin等试剂由广州赛哲生物科技有限公司提供。
1.2 方法
1.2.1 细胞样品制备 大鼠C6细胞常规培养，待其进入对数生长期后，调整细胞培养浓度为1×104～1×105/mL，并分为对照组(0 mg/L)、nm23-H2低浓度组(25 mg/L)和nm23-H2高浓度组(50 mg/L)3组，20 h后收集细胞样品，加入RIPA裂解缓冲液收集裂解物，取上清备用。
1.2.2 Western Blotting 样品行SDS-PAGE， 电转移于PVDF膜上，牛奶封闭液封闭2～4 h，依次加入一抗(抗talin、survivin及对应磷酸化抗体1∶1 000稀释，室温2 h后，加羊抗兔二抗(1∶400 0)，2 h后显影。Image J软件分析检测各组MMP-2、磷酸化的MMP-2、β-actin平均光密度比值均数。
, http://www.100md.com
1.3 统计方法
采用SPSS20.0统计软件包处理数据，所有数据以均数±标准差(x±s)表示，用 t检验。
2 结果
2.1 不同浓度的SB-273005均可明显抑制C6细胞talin表达量及磷酸化
加入不同浓度的SB-273005均可明显抑制talin表达量及磷酸化，且随着SB-273005浓度升高，其对talin表达及磷酸化的抑制呈增高趋势，见图1，2，3。
2.2 不同浓度的SB-273005均可明显抑制C6细胞survivin表达量及磷酸化
加入不同浓度的SB-273005均可明显抑制survivin表达量及磷酸化，并且随着SB-273005浓度升高，其对survivin表达及磷酸化的抑制呈增高趋势。见图4，5，6。
, 百拇医药
2.3 Image J软件分析检测各组MMP-2、磷酸化的MMP-2、β-actin平均光密度比值均数
Image J软件分析检测各组MMP-2、磷酸化的MMP-2、β-actin平均光密度比值均数，以数据表显示。随SB-273005处理浓度的增加，talin、survivin蛋白的表达量及磷酸化水平明显下降，与对照组比较，差异有统计学意义(*P<0.05)；与SB-273005低浓度组比较，差异有统计学意义(△P<0.05)，见表1。
表1 各组MMP-2、磷酸化的MMP-2、β-actin平均光密度比值均数
3 讨论
目前研究证实，整合素αvβ3参与多条信号通路的调控，通过与ECM配体结合，促成黏着斑复合物的形成[3]。同时，该复合物所包含的配体以及其他信号分子暴露其活化位点，通过与下游的染色质片段或蛋白相互作用[4]，产生相应的生物学效应。
该研究结果显示：各实验组通过加入不同浓度的αvβ3拮抗剂SB-273005均能明显降低C6细胞talin蛋白的表达，对其磷酸化有明显的抑制作用。测得对照组、SB-273005低浓度组和SB-273005高浓度组磷酸化的talin/β-actin的平均光密度比值分别为0.82、0.33、0.15(*P<0.05)。3组相比，差异有统计学意义。国内外学者同样证实，talin蛋白的磷酸化主要通过C-端区上的序列发挥作用，且多在细胞粘附之前，就已完成多个酪氨酸位点的磷酸化。其中，最重要的自主磷酸化部位Tyr397在这一过程中起至关重要的作用[5]。这与实验中，磷酸化的talin的检测结果相符。并提示talin有可能是整合素黏着斑形成初期所依赖的基础分子，多个磷酸化位点为后期整合素相关信号通路激活发挥重要作用[6]。, 百拇医药(尚发军 艾文兵 熊志云 冯定坤 彭智)
, http://www.100md.com
[关键词] C6神经胶质瘤细胞；踝蛋白；生存素； SB-273005
[中图分类号] R3 [文献标识码] A [文章编号] 1674-0742(2014)12(a)-0044-02
目前研究发现，在胶质瘤细胞中，talin、survivin所能发挥的生物学作用与整合素αvβ3的活性状态密切相关[1]。talin与survivin蛋白的磷酸化水平与胶质瘤恶性程度存在关联性，胶质瘤的恶性程度越高，二者的磷酸化水平随之增高[2]。因此，该实验2013年12月—2014年6月间通过采用整合素αvβ3拮抗剂SB-273005，抑制整合素活性，观察整合素αvβ3的活性改变后与talin、survivin的表达量及其磷酸化是否存在相关性，并探讨其作用机制，以期为脑胶质瘤的治疗寻求更有效的方法，报道如下。
1 材料与方法
1.1 材料
, http://www.100md.com
实验自2013年12月开始，2014年6月结束。C6神经胶质瘤细胞由南方医科大学神经外科实验室提供；整合素αvβ3拮抗剂SB-273005为Dupont公司产品；抗talin抗体、survivin抗体、survivin磷酸化单克隆抗体购于武汉博士德生物公司； DMEM培养基、FBS、RIPA缓冲液、TBST液、HRP-羊抗兔LgG、Rabbit Anti-β-Actin等试剂由广州赛哲生物科技有限公司提供。
1.2 方法
1.2.1 细胞样品制备 大鼠C6细胞常规培养，待其进入对数生长期后，调整细胞培养浓度为1×104～1×105/mL，并分为对照组(0 mg/L)、nm23-H2低浓度组(25 mg/L)和nm23-H2高浓度组(50 mg/L)3组，20 h后收集细胞样品，加入RIPA裂解缓冲液收集裂解物，取上清备用。
1.2.2 Western Blotting 样品行SDS-PAGE， 电转移于PVDF膜上，牛奶封闭液封闭2～4 h，依次加入一抗(抗talin、survivin及对应磷酸化抗体1∶1 000稀释，室温2 h后，加羊抗兔二抗(1∶400 0)，2 h后显影。Image J软件分析检测各组MMP-2、磷酸化的MMP-2、β-actin平均光密度比值均数。
, http://www.100md.com
1.3 统计方法
采用SPSS20.0统计软件包处理数据，所有数据以均数±标准差(x±s)表示，用 t检验。
2 结果
2.1 不同浓度的SB-273005均可明显抑制C6细胞talin表达量及磷酸化
加入不同浓度的SB-273005均可明显抑制talin表达量及磷酸化，且随着SB-273005浓度升高，其对talin表达及磷酸化的抑制呈增高趋势，见图1，2，3。
2.2 不同浓度的SB-273005均可明显抑制C6细胞survivin表达量及磷酸化
加入不同浓度的SB-273005均可明显抑制survivin表达量及磷酸化，并且随着SB-273005浓度升高，其对survivin表达及磷酸化的抑制呈增高趋势。见图4，5，6。
, 百拇医药
2.3 Image J软件分析检测各组MMP-2、磷酸化的MMP-2、β-actin平均光密度比值均数
Image J软件分析检测各组MMP-2、磷酸化的MMP-2、β-actin平均光密度比值均数，以数据表显示。随SB-273005处理浓度的增加，talin、survivin蛋白的表达量及磷酸化水平明显下降，与对照组比较，差异有统计学意义(*P<0.05)；与SB-273005低浓度组比较，差异有统计学意义(△P<0.05)，见表1。
表1 各组MMP-2、磷酸化的MMP-2、β-actin平均光密度比值均数
3 讨论
目前研究证实，整合素αvβ3参与多条信号通路的调控，通过与ECM配体结合，促成黏着斑复合物的形成[3]。同时，该复合物所包含的配体以及其他信号分子暴露其活化位点，通过与下游的染色质片段或蛋白相互作用[4]，产生相应的生物学效应。
该研究结果显示：各实验组通过加入不同浓度的αvβ3拮抗剂SB-273005均能明显降低C6细胞talin蛋白的表达，对其磷酸化有明显的抑制作用。测得对照组、SB-273005低浓度组和SB-273005高浓度组磷酸化的talin/β-actin的平均光密度比值分别为0.82、0.33、0.15(*P<0.05)。3组相比，差异有统计学意义。国内外学者同样证实，talin蛋白的磷酸化主要通过C-端区上的序列发挥作用，且多在细胞粘附之前，就已完成多个酪氨酸位点的磷酸化。其中，最重要的自主磷酸化部位Tyr397在这一过程中起至关重要的作用[5]。这与实验中，磷酸化的talin的检测结果相符。并提示talin有可能是整合素黏着斑形成初期所依赖的基础分子，多个磷酸化位点为后期整合素相关信号通路激活发挥重要作用[6]。, 百拇医药(尚发军 艾文兵 熊志云 冯定坤 彭智)