定量蛋白质组学在纳米银材料中的研究进展(1)
[摘要] iTRAQ是2004年开发的一种新的同位素标记试剂，结合MRM技术已经被广泛的应用于细菌、酵母、体液、微生物、人体组织和细胞等多种样本的蛋白质鉴定、定量以及对目的蛋白的验证中。目前，由于iTRAQ能同时对2-8组样品进行标记分析并具有高通量、重复性、敏感性高等特点使其为进行纳米银生物医学材料毒性评估提供了有力的技术平台。
[关键词] 同位素相对与绝对定量技术；多反应监测；纳米银；蛋白质
[中图分类号] R341 [文献标识码] A [文章编号] 1674-0742(2014)12(b)-0196-03
近年来研究蛋白质相对和绝对定量的常用质谱分析技术是同位素标记，如2004年开发的较新的技术iTRAQ等。采用iTRAQ进行蛋白质的相对和绝对定量，其结果可以得到500～600种蛋白。通过大规模数据分析，采用质谱多反应监测(MRM)对筛选出来的蛋白进行确证。MRM技术是一种基于已知信息或假定信息有针对性地获取数据，进行质谱信号采集的技术。目前，它已经成为生物标志物大规模临床确诊的主要手段。未来，iTRAQ 结合MRM 在探求未知复杂疾病领域中将成为一种有效性和可靠性较高的技术[2]。
, 百拇医药
纳米技术是在0.1～100 nm 空间尺度内操纵原子和分子，研究物质的特性和相互作用，并利用这些特性的多学科交叉的一门综合性科学技术[3-4]。然而，如何评价纳米材料的毒性和安全性还没有统一的标准。我国食品药品监督管理局报道，到目前为止我国已有188件国产纳米医疗器械和6件进口纳米医疗器械通过了国家局或省级药监局的审批进行临床应用[5]。迄今，有关纳米银对人体的负效应，尤其是长期频繁或大量使用时的慢性毒性尚不清楚。因此，建立完善的既符合我国特点又与国际接轨的技术标准体系，保证其安全使用是至关重要的。
综上，该文就iTRAQ结合MRM技术及其在纳米生物医学材料毒性评估中的现状及进展进行综述。
1 iTRAQ技术特点和应用领域
1.1 iTRAQ技术特点
在一次实验中可同时标记2～8个样品，一次实验实现多达8个样品的蛋白质鉴定和定量，定性与定量同时进行；适用范围较广；所需样品较少，可处理微量样品；13C，15N，18O在 scx 或 RP预分离时，不会影响肽段的行为，任意肽段理论上都可能被标记，拥有极高的标记效率；每个蛋白都有多个肽段被标记，提高了鉴定和定量可靠性；平衡集团在质谱碎裂时会中性丢失，不争夺电荷，鉴定时，来源于不同样品的报告集团会分离得很清楚(113-121Da， skip120)，而来源于不同样品的相同肽段在质谱上表现为一同个峰，强度叠加可有效改善图谱鉴定，有利于鉴定。
, 百拇医药
1.2 iTRAQ的应用领域
iTRAQ试剂可用于标记不同性质的样品，如微生物(500 mg)，动物组织(500 mg)[6]，植物组织(500 mg)[7]，细胞(106～107)，体液(羊水，脑脊液，尿液等)，血清/血浆(200～300 μl)， 细胞器[8]。iTRAQ技术不仅可发现胞浆蛋白，还有膜蛋白、核蛋白、胞外蛋白，它可以检测出低丰度蛋白、强碱性蛋白、<10 KD或>200 KD的蛋白；可以进行多个时间点蛋白质组动态变化的监测；可以分析详细分期/型的临床疾病样本，并可设计样本重复；甚至可以进行个体样本的研究、细胞周期、细胞信号传导整个过程的蛋白质组动态蛋白质组学的研究。在差异蛋白质组学研究中，iTRAQ技术可用来寻找生物标志物，进行时间过程样本分析，不同处理方法样本差异以及信号通路的研究。
2 MRM技术特点和应用领域
2.1 MRM技术特点
, 百拇医药
(1)灵敏度高：通过两级离子选择，排除大量干扰离子，使质谱的化学背景降低，目标检测物的信噪比显著提高，从而实现检测的高灵敏度。(2)重现性好：在MRM 技术选择性的质谱信号采集中，避免了待测分子离子化、质谱信号的抑制及源内碰撞碎裂过程的影响，因此重现性也相应提高。(3)准确度高：利用MRM技术的特异性，进行连续增强的离子扫描分析，得到高分辨的串联质谱(MS/MS)碎片数据，与全扫描和中性丢失质谱扫描模式相比降低了分析过程中定性结果的假阳性率，保证了分析的准确度。(4) 通量高：使用目前最先进的质谱系统，MRM技术每个工作循环能处理多达300对母离子-子离子对，这种特点为研究多种蛋白质的多种修饰和丰度变化提供了机会，更能满足蛋白质组学的研究需求。
2.2 MRM的应用领域
生物标志物的研究是医学领域研究的热点。目前，标志物发现-验证-临床确证的研究模式已经得到广泛的认可。即在发现阶段从疾病组织中寻找与正常组织的差异蛋白质到到验证阶段使用MRM技术进行临床确证。MRM技术在验证和确证阶段都弥补了经典免疫学原理利用抗体进行验证确证的缺点，充分体现了该技术在生物标志物检测领域中的价值。
, http://www.100md.com
蛋白质翻译后修饰在许多生命活动的调节过程中起重要作用，例如，在蛋白质磷酸化修饰中，MRM技术在翻译后修饰的研究领域中显示了独特的特点和优势磷酸化蛋白质被酶切后，磷酸化多肽的信号淹没在大量非磷酸化多肽的信号中需要进行磷酸化富集来提高分析灵敏度，改善分析效果。MRM技术在定量蛋白质组学应用上也展现了其方法的优点。首先，在一定程度上提高了测定的动态范围其原因一方面是因为对离子的选择检出，降低了复杂组分的背景信号，增加了一些低丰度蛋白质的检测灵敏度；另一方面通过对高丰度、低丰度蛋白质MR离子对的选择来均衡两者的响应信号差异。例如，对高丰度蛋白质，选择响应丰度较低的母离子-子离子对；对低丰度蛋白质，选择响应程度较高的母离子-子离子对，从而均衡高、低丰度的信号差异。其次，减少了复杂组分流产物的干扰，增强了检测的特异性。此外，MRM技术高通量的特点，也为多种蛋白质的同时定量提供了条件[9]。, 百拇医药(刘赞 于滢 孙明波 陈文博 戴政宁 钟飞 余洋)
[关键词] 同位素相对与绝对定量技术；多反应监测；纳米银；蛋白质
[中图分类号] R341 [文献标识码] A [文章编号] 1674-0742(2014)12(b)-0196-03
近年来研究蛋白质相对和绝对定量的常用质谱分析技术是同位素标记，如2004年开发的较新的技术iTRAQ等。采用iTRAQ进行蛋白质的相对和绝对定量，其结果可以得到500～600种蛋白。通过大规模数据分析，采用质谱多反应监测(MRM)对筛选出来的蛋白进行确证。MRM技术是一种基于已知信息或假定信息有针对性地获取数据，进行质谱信号采集的技术。目前，它已经成为生物标志物大规模临床确诊的主要手段。未来，iTRAQ 结合MRM 在探求未知复杂疾病领域中将成为一种有效性和可靠性较高的技术[2]。
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纳米技术是在0.1～100 nm 空间尺度内操纵原子和分子，研究物质的特性和相互作用，并利用这些特性的多学科交叉的一门综合性科学技术[3-4]。然而，如何评价纳米材料的毒性和安全性还没有统一的标准。我国食品药品监督管理局报道，到目前为止我国已有188件国产纳米医疗器械和6件进口纳米医疗器械通过了国家局或省级药监局的审批进行临床应用[5]。迄今，有关纳米银对人体的负效应，尤其是长期频繁或大量使用时的慢性毒性尚不清楚。因此，建立完善的既符合我国特点又与国际接轨的技术标准体系，保证其安全使用是至关重要的。
综上，该文就iTRAQ结合MRM技术及其在纳米生物医学材料毒性评估中的现状及进展进行综述。
1 iTRAQ技术特点和应用领域
1.1 iTRAQ技术特点
在一次实验中可同时标记2～8个样品，一次实验实现多达8个样品的蛋白质鉴定和定量，定性与定量同时进行；适用范围较广；所需样品较少，可处理微量样品；13C，15N，18O在 scx 或 RP预分离时，不会影响肽段的行为，任意肽段理论上都可能被标记，拥有极高的标记效率；每个蛋白都有多个肽段被标记，提高了鉴定和定量可靠性；平衡集团在质谱碎裂时会中性丢失，不争夺电荷，鉴定时，来源于不同样品的报告集团会分离得很清楚(113-121Da， skip120)，而来源于不同样品的相同肽段在质谱上表现为一同个峰，强度叠加可有效改善图谱鉴定，有利于鉴定。
, 百拇医药
1.2 iTRAQ的应用领域
iTRAQ试剂可用于标记不同性质的样品，如微生物(500 mg)，动物组织(500 mg)[6]，植物组织(500 mg)[7]，细胞(106～107)，体液(羊水，脑脊液，尿液等)，血清/血浆(200～300 μl)， 细胞器[8]。iTRAQ技术不仅可发现胞浆蛋白，还有膜蛋白、核蛋白、胞外蛋白，它可以检测出低丰度蛋白、强碱性蛋白、<10 KD或>200 KD的蛋白；可以进行多个时间点蛋白质组动态变化的监测；可以分析详细分期/型的临床疾病样本，并可设计样本重复；甚至可以进行个体样本的研究、细胞周期、细胞信号传导整个过程的蛋白质组动态蛋白质组学的研究。在差异蛋白质组学研究中，iTRAQ技术可用来寻找生物标志物，进行时间过程样本分析，不同处理方法样本差异以及信号通路的研究。
2 MRM技术特点和应用领域
2.1 MRM技术特点
, 百拇医药
(1)灵敏度高：通过两级离子选择，排除大量干扰离子，使质谱的化学背景降低，目标检测物的信噪比显著提高，从而实现检测的高灵敏度。(2)重现性好：在MRM 技术选择性的质谱信号采集中，避免了待测分子离子化、质谱信号的抑制及源内碰撞碎裂过程的影响，因此重现性也相应提高。(3)准确度高：利用MRM技术的特异性，进行连续增强的离子扫描分析，得到高分辨的串联质谱(MS/MS)碎片数据，与全扫描和中性丢失质谱扫描模式相比降低了分析过程中定性结果的假阳性率，保证了分析的准确度。(4) 通量高：使用目前最先进的质谱系统，MRM技术每个工作循环能处理多达300对母离子-子离子对，这种特点为研究多种蛋白质的多种修饰和丰度变化提供了机会，更能满足蛋白质组学的研究需求。
2.2 MRM的应用领域
生物标志物的研究是医学领域研究的热点。目前，标志物发现-验证-临床确证的研究模式已经得到广泛的认可。即在发现阶段从疾病组织中寻找与正常组织的差异蛋白质到到验证阶段使用MRM技术进行临床确证。MRM技术在验证和确证阶段都弥补了经典免疫学原理利用抗体进行验证确证的缺点，充分体现了该技术在生物标志物检测领域中的价值。
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蛋白质翻译后修饰在许多生命活动的调节过程中起重要作用，例如，在蛋白质磷酸化修饰中，MRM技术在翻译后修饰的研究领域中显示了独特的特点和优势磷酸化蛋白质被酶切后，磷酸化多肽的信号淹没在大量非磷酸化多肽的信号中需要进行磷酸化富集来提高分析灵敏度，改善分析效果。MRM技术在定量蛋白质组学应用上也展现了其方法的优点。首先，在一定程度上提高了测定的动态范围其原因一方面是因为对离子的选择检出，降低了复杂组分的背景信号，增加了一些低丰度蛋白质的检测灵敏度；另一方面通过对高丰度、低丰度蛋白质MR离子对的选择来均衡两者的响应信号差异。例如，对高丰度蛋白质，选择响应丰度较低的母离子-子离子对；对低丰度蛋白质，选择响应程度较高的母离子-子离子对，从而均衡高、低丰度的信号差异。其次，减少了复杂组分流产物的干扰，增强了检测的特异性。此外，MRM技术高通量的特点，也为多种蛋白质的同时定量提供了条件[9]。, 百拇医药(刘赞 于滢 孙明波 陈文博 戴政宁 钟飞 余洋)
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