姜黄素对人结肠癌Lovo细胞VEGF表达的影响(1)
[摘要] 目的 研究姜黄素体外对人结肠癌Lovo细胞血管内皮生长因子VEGF表达的影响。方法 不同浓度(0 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L)姜黄素处理2013年8月—2014年2月中南大学提供的人结肠癌细胞株Lovo24 h后，用Real-time PCR检测姜黄素对人结肠癌细胞株血管内皮生长因子VEGF mRNA表达的变化，用Western blot法检测姜黄素对人结肠癌细胞株VEGF蛋白表达的变化。 结果 人结肠癌Lovo细胞经过姜黄素处理24 h后，5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L姜黄素组VEGF mRNA及蛋白的表达均明显下降，与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论 姜黄素能下调人结肠癌Lovo细胞VEGF的表达，并呈剂量依赖，这可能是姜黄素抑制结肠癌Lovo细胞增殖及侵袭性的机制之一。
[关键词] 姜黄素；结肠癌；血管内皮生长因子
, 百拇医药 [中图分类号] R587.1 [文献标识码] A [文章编号] 1674-0742(2014)12(b)-0035-03
姜黄素是从姜科姜黄属植物姜黄、莪术、郁金等的根茎中提取的一种天然有效成分，具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化等多种药理作用，且毒性低，具有良好的临床应用潜力，尤其是其抗肿瘤作用受到国内外广泛关注。结肠癌是常见的恶性肿瘤之一，虽然近年来以手术、化疗、放疗、免疫等的综合治疗手段取得了一定的进展，但其死亡率仍居高不下，毒性作用依然限制着化疗药物和免疫制剂等的应用和疗效。有研究表明，姜黄素能显著抑制结肠癌HCT-116细胞的生长[1]，姜黄素能显著抑制人结肠癌Lovo细胞的增殖并促进其凋亡[2]，研究证实在肿瘤的侵袭、转移过程中，血管内皮生长因子(VEGF)起到了极其重要的作用[3]。该实验以2013年8月—2014年2月中南大学提供的结肠癌Lovo细胞作为研究对象，观察了不同浓度姜黄素对结肠癌Lovo细胞VEGF表达的影响，以求从多角度对姜黄素对结肠癌细胞的作用进行研究，对结肠癌临床治疗提供有益的理论依据，现报道如下。
, 百拇医药
1 资料与方法
1.1 一般资料
人结肠癌Lovo细胞由中南大学肿瘤研究所提供；姜黄素购自Sigma公司，称取3.684 mg的原料药充分溶解于1 mL DMSO中，得到终浓度为10 mmol/L的母液，临用时用完全细胞培养液稀释到所需浓度。 Trizol、逆转录试剂盒购自大连宝生物公司， 引物由大连宝生物公司合成。蛋白提取液及ECL发光试剂盒购自Pierce公司， 兔抗人VEGF多克隆抗体及羊抗兔二抗lgG购自Santa Cruz公司。
1.2 细胞的培养及处理
人结肠癌Lovo细胞接种于含10%胎牛血清1640培养基，置于37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中培养，隔天换液，待细胞长至对数生长期时，用0.25%胰蛋白酶消化传代。取对数生长期的Lovo细胞，实验分组为对照组(姜黄素0 μmol/L，加入等量DMSO)，姜黄素5 μmol/L，10 μmol/L，20 μmol/L，40 μmol/L组，处理后再置于37℃、5%CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养24 h。
, http://www.100md.com
1.3 Real-time PCR
采用Trizo1试剂一步法提取细胞总RNA ，紫外分光光度计测定总RNA浓度，计算OD260/ 280，比值在1.8～2.0的RNA标本用于反转录。总RNA按说明书进行逆转录反应合成cDNA， 逆转录产物cDNA用于Real-time-PCR扩增。VEGF引物：5'端：5'-GGGGGATCCGCCTCCGAA-ACCATGAACTT-3'及3'端：5'-CCCGAATTCTCCTGGTGAGAGA-TCTGGTT-3'，变性、退火温度为94℃与72℃，40个循环。利用标准曲线，根据样品CT值计算出样品中所含的模板量。
1.4 Western Blot
用蛋白提取液提取细胞蛋白， BCA测总蛋白质浓度。蛋白样品用10%SDS聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，上样量为20 μg。5%脱脂奶粉TBS缓冲液封闭，4℃过夜，加兔抗人VEGF多克隆抗体( 1：500)室温2 h， 洗膜30 min， 加入羊抗兔二抗( 1：1000)室温结合1 h， ECL显色， 内参采用β-actin。采用Image-Pro Plus6.0图像分析软件对蛋白条带进行灰度分析。以VEGF条带与内参β-actin条带的灰度比值代表VEGF蛋白的表达水平。
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1.5 统计方法
实验所得计量数据以(x±s)表示， 采用SPSS13.0软件进行方差分析和t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 不同剂量姜黄素对人结肠癌Lovo细胞VEGF mRNA表达的影响
利用Primer 3.0软件分别设计出扩增人VEGF和GAPDH mRNA的引物， Real-time PCR检测VEGF mRNA的表达，见表1，并用EXCEL做出各组VEGF mRNA相对表达量柱状图表达，见图1，姜黄素5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L组与对照组相比，VEGF mRNA的表达均明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)，且呈剂量依赖性。
表1 姜黄素处理后，Lovo细胞VEGF mRNA和蛋白的相对表达(x±s)
2.2 不同剂量姜黄素对人结肠癌Lovo细胞VEGF蛋白表达的影响
不同剂量姜黄素处理Lovo细胞，收集细胞总蛋白，用Western Blot检测VEGF蛋白的表达(结果见图2)，并用Image-Pro Plus6.0对图像进行灰度分析(结果见表1，图3)，姜黄素5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L组与对照组相比VEGF蛋白表达均明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)，且呈剂量依赖性。, http://www.100md.com(袁琦 张征 胡小宣)
[关键词] 姜黄素；结肠癌；血管内皮生长因子
, 百拇医药 [中图分类号] R587.1 [文献标识码] A [文章编号] 1674-0742(2014)12(b)-0035-03
姜黄素是从姜科姜黄属植物姜黄、莪术、郁金等的根茎中提取的一种天然有效成分，具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化等多种药理作用，且毒性低，具有良好的临床应用潜力，尤其是其抗肿瘤作用受到国内外广泛关注。结肠癌是常见的恶性肿瘤之一，虽然近年来以手术、化疗、放疗、免疫等的综合治疗手段取得了一定的进展，但其死亡率仍居高不下，毒性作用依然限制着化疗药物和免疫制剂等的应用和疗效。有研究表明，姜黄素能显著抑制结肠癌HCT-116细胞的生长[1]，姜黄素能显著抑制人结肠癌Lovo细胞的增殖并促进其凋亡[2]，研究证实在肿瘤的侵袭、转移过程中，血管内皮生长因子(VEGF)起到了极其重要的作用[3]。该实验以2013年8月—2014年2月中南大学提供的结肠癌Lovo细胞作为研究对象，观察了不同浓度姜黄素对结肠癌Lovo细胞VEGF表达的影响，以求从多角度对姜黄素对结肠癌细胞的作用进行研究，对结肠癌临床治疗提供有益的理论依据，现报道如下。
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1 资料与方法
1.1 一般资料
人结肠癌Lovo细胞由中南大学肿瘤研究所提供；姜黄素购自Sigma公司，称取3.684 mg的原料药充分溶解于1 mL DMSO中，得到终浓度为10 mmol/L的母液，临用时用完全细胞培养液稀释到所需浓度。 Trizol、逆转录试剂盒购自大连宝生物公司， 引物由大连宝生物公司合成。蛋白提取液及ECL发光试剂盒购自Pierce公司， 兔抗人VEGF多克隆抗体及羊抗兔二抗lgG购自Santa Cruz公司。
1.2 细胞的培养及处理
人结肠癌Lovo细胞接种于含10%胎牛血清1640培养基，置于37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中培养，隔天换液，待细胞长至对数生长期时，用0.25%胰蛋白酶消化传代。取对数生长期的Lovo细胞，实验分组为对照组(姜黄素0 μmol/L，加入等量DMSO)，姜黄素5 μmol/L，10 μmol/L，20 μmol/L，40 μmol/L组，处理后再置于37℃、5%CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养24 h。
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1.3 Real-time PCR
采用Trizo1试剂一步法提取细胞总RNA ，紫外分光光度计测定总RNA浓度，计算OD260/ 280，比值在1.8～2.0的RNA标本用于反转录。总RNA按说明书进行逆转录反应合成cDNA， 逆转录产物cDNA用于Real-time-PCR扩增。VEGF引物：5'端：5'-GGGGGATCCGCCTCCGAA-ACCATGAACTT-3'及3'端：5'-CCCGAATTCTCCTGGTGAGAGA-TCTGGTT-3'，变性、退火温度为94℃与72℃，40个循环。利用标准曲线，根据样品CT值计算出样品中所含的模板量。
1.4 Western Blot
用蛋白提取液提取细胞蛋白， BCA测总蛋白质浓度。蛋白样品用10%SDS聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，上样量为20 μg。5%脱脂奶粉TBS缓冲液封闭，4℃过夜，加兔抗人VEGF多克隆抗体( 1：500)室温2 h， 洗膜30 min， 加入羊抗兔二抗( 1：1000)室温结合1 h， ECL显色， 内参采用β-actin。采用Image-Pro Plus6.0图像分析软件对蛋白条带进行灰度分析。以VEGF条带与内参β-actin条带的灰度比值代表VEGF蛋白的表达水平。
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1.5 统计方法
实验所得计量数据以(x±s)表示， 采用SPSS13.0软件进行方差分析和t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 不同剂量姜黄素对人结肠癌Lovo细胞VEGF mRNA表达的影响
利用Primer 3.0软件分别设计出扩增人VEGF和GAPDH mRNA的引物， Real-time PCR检测VEGF mRNA的表达，见表1，并用EXCEL做出各组VEGF mRNA相对表达量柱状图表达，见图1，姜黄素5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L组与对照组相比，VEGF mRNA的表达均明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)，且呈剂量依赖性。
表1 姜黄素处理后，Lovo细胞VEGF mRNA和蛋白的相对表达(x±s)
2.2 不同剂量姜黄素对人结肠癌Lovo细胞VEGF蛋白表达的影响
不同剂量姜黄素处理Lovo细胞，收集细胞总蛋白，用Western Blot检测VEGF蛋白的表达(结果见图2)，并用Image-Pro Plus6.0对图像进行灰度分析(结果见表1，图3)，姜黄素5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L组与对照组相比VEGF蛋白表达均明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)，且呈剂量依赖性。, http://www.100md.com(袁琦 张征 胡小宣)
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