肠道病毒的PCR检测方法评价与改进(2)
Reed-Muench法：观察CPE， 找出能引起半数细胞瓶或管感染的病毒稀释倍数，按以下公式计算出该病毒液的TCID50。
logTCID50=高于50%的病毒稀释度的对数+距离比例×稀释系数的对数距离比例=(高于50%的百分数-50%)/(高于50%的百分数-低于50%的百分数)。
1.3 统计方法
选用统计学软件SPSS13.0对试验数据实施系统化处理，运用χ2对试验所得计数数据进行检验。当对比差异P<0.05时，差异有统计学意义。
2 结果
2.1 PCR检测方法与病毒分离检测方法
50例患者中通过PCR检测方法检测出EV-RNA阳性的为20例，检出率为40%；病毒分离法分离出病毒4株，检出率为8%，其中CoxB 1型为1株、4型为2株、埃可病毒15型为1株。在PCR检测方法检测的20例阳性中，分离病毒检测出其中阴性的12例，两者共同检测为阳性的4例，两者共同检测为阴性的为34例，总符合率为81.9%(见表1)。两种方法对比之后差别非常显著，差异χ2=8.748，P<0.05，有统计学意义。对照组中的20例，病毒分离没有分离出病毒，PCR检测方法检测出阳性1例，误差率为2%。
, 百拇医药
表1 PCR检测方法与病毒分离检测方法检测结果[n(%)]
2.2 ELISA检测方法与中和CoxB V中和抗体检测方法
50例患者中用ELISA方法检测阳性为12例，阳性率为24%；CoxB V中和抗体检测出阳性为10例，阳性率为20%；两种方法检测都为阳性的共10例。ELISA检测为阳性的12例中，CoxB V中和抗体检测方法检测为阴性的共2例，两种方法都为阴性的35例，总符合率为96.8%，两种方面差异无统计学意义(χ2=0.149，P>0.05)。见表2。
表2 ELISA检测与中和CoxB V中和抗体检测结果[n(%)]
3.4 对比结果
通过上述的实验结果表明，PCR能够更加快速、特异与可靠的进行诊断，在当天就能够得到检测结果。在50例患者中阳性20例(40%)，而病毒分离仅仅4例(8%)。在病毒分离阳性的4例中，PCR阳性4例，此外的16例PCR阳性病例病毒分离全部为阴性，因此PCR的敏感度较高，差异有统计学意义(χ2=8.748，P<0.05)。
, 百拇医药
3 讨论
PCR是体外DNA或RNA扩增的方法，这种扩增具有选择性[7]。通过对特定的微生物物种的特异性基因区域进行体外扩增，然后通过一定的DNA分析技术确定微生物的种类与含量。PCR反应主要包括三个阶段：对目标DNA系列进行加热变性；引物退火复性；在聚合酶作用之下DNA进行引物延伸。PCR检测方法特异性高，能够在较高的温度之下进行连续反应；敏感度高能够将微量的把DNA进行百万倍以上的扩增，能够满足检测分析所需要的DNA数量；反应速度快，PCR能够在2 h内完成30次左右的循环扩增；可扩增RNA或cDNA，能够利用寡脱氧胸昔引物和逆转录酶将mRNA转变成单链cDNA，再将单链cDNA进行扩增，在mRNA很少的情况之下也能够进行序列分析。通用引物PCR特点为使用一对引物对多个模板进行同时扩增，但扩增产物大小相同，难以区分。多重PCR采用多对引物对多个模板同时扩增，按照产物片段不同长度进行鉴别，但是引物多，结果会产生一定差异。该研究肠道病毒检测中将二者结合，取长补短。
, 百拇医药
袁长青[7]等人研究发现，PCR检测方法是利用肠道病毒的特异性引物检测标本中和肠道病毒RNA同源的基因序列，将其作为判断结果的依据。对DNA进行重复的扩增之后检测方面的灵敏度能够增加大10-5～10-6 μg。该研究结果显示， 50例患者中通过PCR检测方法检测出EV-RNA阳性的为20例，检出率为40%，这说明PCR检测方法具有特异性高、敏感度高、速度较快，能够更加快速、特异与可靠的进行诊断。
朱坤[8]等人指出，在肠道病毒的PCR检测过程中也会出现一些问题。主要包含：假阳性问题，是指不应该出现阳性结果时出现了阳性结果；假阴性问题，是指在应该出现阳性结果的时候并没有出现阳性结果。该研究结果显示，在PCR检测方法检测的20例阳性中，分离病毒检测出其中阴性的12例，两者共同检测为阳性的4例，两者共同检测为阴性的为34例，总符合率为81.9%。由此可见，PCR技术灵敏度、特异性等方面有了较大的发展，而且已经在分子生物学等学科中得到了广泛的使用，有着不可比拟的优越性。虽然在某些方面依旧存在着一些局限性，但是随着PCR技术与其他各项技术的不断发展，将能够弥补这些缺陷，成为生物技术发展领域的趋势所在。
, http://www.100md.com
[参考文献]
[1] 张崇森，刘永军，王晓昌.环境水体中肠道病毒的膜吸附一洗脱浓缩方法的研究[J].环境科学，2007，28(7)：1543-1547.
[2] 费选文，林祥伟，谢若男.应用4种方法检测肠道病毒的结果分析[J].海峡预防医学杂志，2009，9(1)：45-46.
[3] 裘湛，闻岳，黄翔峰.PcR-DGGE技术在水解酸化缺氧法处理采油废水的微生物研究中的应用[J].环境污染与防治，2006，28(6)：439-442.
[4] 吴小兵，董小岩，伍志坚.一种快速高效分离腺病毒伴随病毒的方法[J].科学通报，2010，45(19)：2071-2075.
[5] 沈晓丽.点免疫结合试验测定柯萨奇病毒B组抗体在临床的应用[J].中华心血管杂志， 2011 ，20( 2)：1129-1134.
[6] 牛玉宏，杨英珍，虞勇.肠道病毒基因实时定量RT-cR方法的建立[J].复旦学报(医学科学版)，2001，28(6)：542-544.
[7] 袁长青，叶建锋，李君文.改进的PCR技术快速检测水中肠道病毒的研究[J].中国卫生检验杂志，2011，12(4)：132-133.
[8] 朱坤，高秀杰，邓中平，等.肠道病毒71型实时荧光RT-PCR检测方法的建立及临床评价[J].热带医学杂志，2010，16(5)：414-415.
(收稿日期：2014-09-15), 百拇医药(王芳)
logTCID50=高于50%的病毒稀释度的对数+距离比例×稀释系数的对数距离比例=(高于50%的百分数-50%)/(高于50%的百分数-低于50%的百分数)。
1.3 统计方法
选用统计学软件SPSS13.0对试验数据实施系统化处理，运用χ2对试验所得计数数据进行检验。当对比差异P<0.05时，差异有统计学意义。
2 结果
2.1 PCR检测方法与病毒分离检测方法
50例患者中通过PCR检测方法检测出EV-RNA阳性的为20例，检出率为40%；病毒分离法分离出病毒4株，检出率为8%，其中CoxB 1型为1株、4型为2株、埃可病毒15型为1株。在PCR检测方法检测的20例阳性中，分离病毒检测出其中阴性的12例，两者共同检测为阳性的4例，两者共同检测为阴性的为34例，总符合率为81.9%(见表1)。两种方法对比之后差别非常显著，差异χ2=8.748，P<0.05，有统计学意义。对照组中的20例，病毒分离没有分离出病毒，PCR检测方法检测出阳性1例，误差率为2%。
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表1 PCR检测方法与病毒分离检测方法检测结果[n(%)]
2.2 ELISA检测方法与中和CoxB V中和抗体检测方法
50例患者中用ELISA方法检测阳性为12例，阳性率为24%；CoxB V中和抗体检测出阳性为10例，阳性率为20%；两种方法检测都为阳性的共10例。ELISA检测为阳性的12例中，CoxB V中和抗体检测方法检测为阴性的共2例，两种方法都为阴性的35例，总符合率为96.8%，两种方面差异无统计学意义(χ2=0.149，P>0.05)。见表2。
表2 ELISA检测与中和CoxB V中和抗体检测结果[n(%)]
3.4 对比结果
通过上述的实验结果表明，PCR能够更加快速、特异与可靠的进行诊断，在当天就能够得到检测结果。在50例患者中阳性20例(40%)，而病毒分离仅仅4例(8%)。在病毒分离阳性的4例中，PCR阳性4例，此外的16例PCR阳性病例病毒分离全部为阴性，因此PCR的敏感度较高，差异有统计学意义(χ2=8.748，P<0.05)。
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3 讨论
PCR是体外DNA或RNA扩增的方法，这种扩增具有选择性[7]。通过对特定的微生物物种的特异性基因区域进行体外扩增，然后通过一定的DNA分析技术确定微生物的种类与含量。PCR反应主要包括三个阶段：对目标DNA系列进行加热变性；引物退火复性；在聚合酶作用之下DNA进行引物延伸。PCR检测方法特异性高，能够在较高的温度之下进行连续反应；敏感度高能够将微量的把DNA进行百万倍以上的扩增，能够满足检测分析所需要的DNA数量；反应速度快，PCR能够在2 h内完成30次左右的循环扩增；可扩增RNA或cDNA，能够利用寡脱氧胸昔引物和逆转录酶将mRNA转变成单链cDNA，再将单链cDNA进行扩增，在mRNA很少的情况之下也能够进行序列分析。通用引物PCR特点为使用一对引物对多个模板进行同时扩增，但扩增产物大小相同，难以区分。多重PCR采用多对引物对多个模板同时扩增，按照产物片段不同长度进行鉴别，但是引物多，结果会产生一定差异。该研究肠道病毒检测中将二者结合，取长补短。
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袁长青[7]等人研究发现，PCR检测方法是利用肠道病毒的特异性引物检测标本中和肠道病毒RNA同源的基因序列，将其作为判断结果的依据。对DNA进行重复的扩增之后检测方面的灵敏度能够增加大10-5～10-6 μg。该研究结果显示， 50例患者中通过PCR检测方法检测出EV-RNA阳性的为20例，检出率为40%，这说明PCR检测方法具有特异性高、敏感度高、速度较快，能够更加快速、特异与可靠的进行诊断。
朱坤[8]等人指出，在肠道病毒的PCR检测过程中也会出现一些问题。主要包含：假阳性问题，是指不应该出现阳性结果时出现了阳性结果；假阴性问题，是指在应该出现阳性结果的时候并没有出现阳性结果。该研究结果显示，在PCR检测方法检测的20例阳性中，分离病毒检测出其中阴性的12例，两者共同检测为阳性的4例，两者共同检测为阴性的为34例，总符合率为81.9%。由此可见，PCR技术灵敏度、特异性等方面有了较大的发展，而且已经在分子生物学等学科中得到了广泛的使用，有着不可比拟的优越性。虽然在某些方面依旧存在着一些局限性，但是随着PCR技术与其他各项技术的不断发展，将能够弥补这些缺陷，成为生物技术发展领域的趋势所在。
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[3] 裘湛，闻岳，黄翔峰.PcR-DGGE技术在水解酸化缺氧法处理采油废水的微生物研究中的应用[J].环境污染与防治，2006，28(6)：439-442.
[4] 吴小兵，董小岩，伍志坚.一种快速高效分离腺病毒伴随病毒的方法[J].科学通报，2010，45(19)：2071-2075.
[5] 沈晓丽.点免疫结合试验测定柯萨奇病毒B组抗体在临床的应用[J].中华心血管杂志， 2011 ，20( 2)：1129-1134.
[6] 牛玉宏，杨英珍，虞勇.肠道病毒基因实时定量RT-cR方法的建立[J].复旦学报(医学科学版)，2001，28(6)：542-544.
[7] 袁长青，叶建锋，李君文.改进的PCR技术快速检测水中肠道病毒的研究[J].中国卫生检验杂志，2011，12(4)：132-133.
[8] 朱坤，高秀杰，邓中平，等.肠道病毒71型实时荧光RT-PCR检测方法的建立及临床评价[J].热带医学杂志，2010，16(5)：414-415.
(收稿日期：2014-09-15), 百拇医药(王芳)