胸水p16基因纯合性缺失的检测及临床应用价值(1)
[摘要] 目的 探讨胸水p16基因纯合性缺失的检测及其在临床上的应用价值。方法 选取该院2010年12月—2014年6月收治的伴有胸水的肺癌患者176例，随机分为对照组和PCR组各88例，对照组应用胸水脱落细胞学检测，PCR组应用PCR技术检测纯合性缺失，比较阳性率。 结果对照组88例肺癌所致癌性胸水患者的标本中有52例出现胸水脱落细胞血阳性结果，其阳性率为59.09%；PCR组88例肺癌所致癌性胸水患者的标本中没有出现一例p16基因第一外显子纯合性缺失，但是有35例p16基因第二外显子纯合性缺失，其阳性率为39.77%。阳性对照组优于PCR组，经统计学处理差异有统计学意义(P<0.05)。 结论 将p16基因作为肺癌治疗的靶基因具有可行性，同时胸水p16基因纯合性缺失的检测方法不仅方便，而且准确率高，可以作为癌症检测和预后的重要辅助手段，为广大的肺癌患者带来福音，值得临床推广。
[关键词] 胸水；p16基因；纯合性缺失；检测；应用价值
[中图分类号] R [文献标识码] A [文章编号] 1674-0742(2014)12(c)-0034-02
, 百拇医药
肺癌是治愈率低和致死率高的呼吸系统肿瘤疾病，其发病率和死亡率逐年急剧上升且具有性别差异，对人类生命健康造成严重威胁。肺癌的发病原因主要是吸烟、电离辐射、职业与环境接触、大气污染、遗传因素和既往肺部慢性感染。其临床表现主要包括局部症状、全身症状、肺外症状、侵润和转移症状，其中局部症状有咳嗽、胸痛、胸闷、气急、咯血和声音嘶哑，而咳嗽是最常见的局部症状，也是肺癌的首发症状[1]。由于缺乏有效的早期诊断方法，40%以上的患者在诊断时病灶已发生转移，经过传统的治疗方法效果也差强人意，尤其是小细胞肺癌患者5年生存率不足5%[2]。因此，如何对伴有胸水的肺癌患者进行准确检测，成为了医学热点。p16基因又称为MTS1基因，于1994年被Kamb等发现的一种新的抗癌基因，它是细胞周期中的一种基本基因，其作用是直接参与细胞周期的调控，对细胞增殖和分裂进行负调节[3]。目前，经研究发现有细胞周期刹车装置之称的p16基因，在人类肿瘤细胞中出现纯合性缺失的现象，同时经临床研究证实很多癌症的形成都与p16基因的缺失和突变有关[4]。因此，对p16基因进行纯合性缺失的检测具有重要的临床意义。将该院2010年12月—2014年6月收治的患者为研究对象，采用胸水p16基因纯合性缺失的检测肺癌收到了较好的效果，现报道如下。
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1 资料与方法
1.1 一般资料
将该院收治的伴有胸水的肺癌患者176例，随机分为两组，其中对照组88例，男61例，女27例，年龄41～75岁，平均年龄58岁；PCR组88例，男62例，女26例；年龄42～74岁，平均年龄58岁。两组在年龄和性别方面差异无统计学意义，具有可比性。
1.2 治疗方法
1.2.1 对照组 在征得患者同意的情况下，对患者的穿刺部位通过超声定位后，协助患者采取合适的体位，局部消毒和麻醉后，进行常规的胸腔穿刺。其具体步骤如下：用左手食指和中指将穿刺部位的皮肤固定，右手调整穿刺针的三通活栓装置，使其与胸腔处于关闭状态后，在麻醉处将穿刺针缓缓刺入，若针锋的抵抗感突然消失时，则调整三通活栓使其与胸腔相通，进行抽取胸水，抽取结束方可拔出穿刺针。取出一定量的胸水后，进行胸水脱落细胞学检测，其检测步骤如下：离心、制片、干燥、染色，其中染色尤为重要，若染色较深，则背景会影响判断；若染色较浅，则不易看出细胞的形态。染色后，将固定好的片子放在显微镜下观察，检测细胞学变化，进行结果统计分析。
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1.2.2 PCR组 胸水采集的方法与对照组一致，取患者的一定量(10 mL)的胸水后，离心(3 000转/min，10 min)，沉淀物加生理盐水混悬后，再加DNA提取液和相关试剂逐步提取和纯化DNA模板。在PCR扩增过程中，要加入PCR试剂，其中PCR的五种关键要素是p16第一外显子和第二外显子引物、dNTP、Taq酶、Mg2+和模板，放入PCR仪中扩增，其PCR条件是预变性94℃、5 min后，变性94℃、30 s，复性55℃、30 s，延伸72℃、30 s，将变性、复性和延伸循环30次后，再延伸70℃、5 min，最后4℃保存产品。配制2%的琼脂糖凝胶，用水平电泳仪进行电泳40 min后，紫外下扫描照相后，检测吸光度值，进行结果统计分析。
1.3 统计方法
应用SPSS11.0软件对数据进行分析，计数资料用率表示，行χ2检验。
2 结果
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两组数据比较，阳性率行χ2检验，χ2 =6.17，P=0.034，P<0.05，说明经处理差异有统计学意义，见表1。
表1 对照组与PCR组检测结果对比[n(%)]
3 讨论
肺癌是发病率较高的呼吸系统肿瘤疾病，其发病率和死亡率逐年急剧上升，并且该病的发病率和死亡率具有性别差异，其中男性患者的发病率和死亡率位居恶性肿瘤的榜首，女性患者的发病率和死亡率位居恶性肿瘤的第二位[5]，但具有较低治愈率和较高致死率的特点，对人类生命健康造成严重威胁。目前，肺癌的发病原因还没有得到明确阐述，有大量研究资料表明[6]：该病可能与吸烟、环境有重大联系，其中不吸烟的肺癌患者占吸烟肺癌患者的1/10～1/20，并且年龄越小就开始吸烟越容易患有肺癌，城市居民患有肺癌的几率比农村的患者高，其主要原因是城市大气污染要比农村更为严重。肺癌的发病原因主要是吸烟、电离辐射、职业与环境接触、大气污染、遗传因素和既往肺部慢性感染，其中吸烟是最严重的肺癌高危因素，而职业癌是常见的肺癌疾病。肺癌具有直接扩散、血行转移和淋巴道转移三种播散转移方式，其中淋巴道转移是最常见的肺癌转移方式。肺癌的临床表现主要包括局部症状、全身症状、肺外症状、侵润和转移症状，其中局部症状有咳嗽、胸痛、胸闷、气急、咯血和声音嘶哑，而咳嗽是最常见的局部症状，也是肺癌的首发症状。p16基因又称为MTS1基因，于1994年被Kamb等发现的一种新的抗癌基因，它是细胞周期中的一种基本基因，其作用是直接参与细胞周期的调控，对细胞增殖和分裂进行负调节[7]。目前，经研究发现人类肿瘤细胞的p16基因有一半会发生纯合性缺失和突变，因此被称为细胞周期的刹车装置，一旦失灵，则细胞会出现恶性增殖，最终导致恶性肿瘤的发生[8]。近几年，临床研究发现，在肺癌、乳腺癌、骨肿瘤、皮肤癌、膀胱癌、脑肿瘤、肾癌、卵巢癌和淋巴瘤等癌细胞中p16基因出现纯合性缺失和突变等现象，证明了p16基因通过缺失和突变的形式，参与了肿瘤的形成。因此在肿瘤患者的易感性和预后方面，对p16基因进行纯合性缺失的检测具有重要的临床意义[9-11]。由于胸水收集方便，该院将肺癌所致胸膜转移后的胸水标本作为研究对象，结果表明，PCR组88例肺癌所致癌性胸水患者的标本中没有出现1例p16基因第一外显子纯合性缺失，但是有35例p16基因第二外显子纯合性缺失，其阳性率为39.77%；对照组88例肺癌所致癌性胸水患者的标本中有52例出现胸水脱落细胞血阳性结果，其阳性率为59.09%。胸水细胞学检测是一种特异性检查手段，病理状态下，在胸水形成的同时，胸膜间皮细胞和恶性肿瘤细胞都会脱落至胸水中，因此可以通过胸水脱落细胞学的检测来诊断疾病。p16基因的编码蛋白是细胞周期素D和依赖性激酶的特异性抑制剂，其抑制肿瘤的机制是通过抑制细胞周期进程而抑制细胞增殖[12-13]。绝大多数肿瘤中存在p16 基因的缺失或突变，并且纯合性缺失发生的频率更高，而且主要发生于第二外显子上，经叶玉坤等研究发现在肺癌组织p16 基因的表达率要远远低于癌组织旁边的正常组织和良性肿瘤的表达率，且表达率的高低与临床分期密切相关，尤其是在Ⅰ期和Ⅱ期肺癌中，p16 基因的纯合性缺失率达到30%以上，并且是非小细胞肺癌[3]。因此，将p16基因作为肺癌治疗的靶基因具有可行性，同时胸水p16基因纯合性缺失的检测方法不仅方便，而且准确率高，可以作为癌症检测和预后的重要辅助手段，值得临床推广。, 百拇医药(于薇)
[关键词] 胸水；p16基因；纯合性缺失；检测；应用价值
[中图分类号] R [文献标识码] A [文章编号] 1674-0742(2014)12(c)-0034-02
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肺癌是治愈率低和致死率高的呼吸系统肿瘤疾病，其发病率和死亡率逐年急剧上升且具有性别差异，对人类生命健康造成严重威胁。肺癌的发病原因主要是吸烟、电离辐射、职业与环境接触、大气污染、遗传因素和既往肺部慢性感染。其临床表现主要包括局部症状、全身症状、肺外症状、侵润和转移症状，其中局部症状有咳嗽、胸痛、胸闷、气急、咯血和声音嘶哑，而咳嗽是最常见的局部症状，也是肺癌的首发症状[1]。由于缺乏有效的早期诊断方法，40%以上的患者在诊断时病灶已发生转移，经过传统的治疗方法效果也差强人意，尤其是小细胞肺癌患者5年生存率不足5%[2]。因此，如何对伴有胸水的肺癌患者进行准确检测，成为了医学热点。p16基因又称为MTS1基因，于1994年被Kamb等发现的一种新的抗癌基因，它是细胞周期中的一种基本基因，其作用是直接参与细胞周期的调控，对细胞增殖和分裂进行负调节[3]。目前，经研究发现有细胞周期刹车装置之称的p16基因，在人类肿瘤细胞中出现纯合性缺失的现象，同时经临床研究证实很多癌症的形成都与p16基因的缺失和突变有关[4]。因此，对p16基因进行纯合性缺失的检测具有重要的临床意义。将该院2010年12月—2014年6月收治的患者为研究对象，采用胸水p16基因纯合性缺失的检测肺癌收到了较好的效果，现报道如下。
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1 资料与方法
1.1 一般资料
将该院收治的伴有胸水的肺癌患者176例，随机分为两组，其中对照组88例，男61例，女27例，年龄41～75岁，平均年龄58岁；PCR组88例，男62例，女26例；年龄42～74岁，平均年龄58岁。两组在年龄和性别方面差异无统计学意义，具有可比性。
1.2 治疗方法
1.2.1 对照组 在征得患者同意的情况下，对患者的穿刺部位通过超声定位后，协助患者采取合适的体位，局部消毒和麻醉后，进行常规的胸腔穿刺。其具体步骤如下：用左手食指和中指将穿刺部位的皮肤固定，右手调整穿刺针的三通活栓装置，使其与胸腔处于关闭状态后，在麻醉处将穿刺针缓缓刺入，若针锋的抵抗感突然消失时，则调整三通活栓使其与胸腔相通，进行抽取胸水，抽取结束方可拔出穿刺针。取出一定量的胸水后，进行胸水脱落细胞学检测，其检测步骤如下：离心、制片、干燥、染色，其中染色尤为重要，若染色较深，则背景会影响判断；若染色较浅，则不易看出细胞的形态。染色后，将固定好的片子放在显微镜下观察，检测细胞学变化，进行结果统计分析。
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1.2.2 PCR组 胸水采集的方法与对照组一致，取患者的一定量(10 mL)的胸水后，离心(3 000转/min，10 min)，沉淀物加生理盐水混悬后，再加DNA提取液和相关试剂逐步提取和纯化DNA模板。在PCR扩增过程中，要加入PCR试剂，其中PCR的五种关键要素是p16第一外显子和第二外显子引物、dNTP、Taq酶、Mg2+和模板，放入PCR仪中扩增，其PCR条件是预变性94℃、5 min后，变性94℃、30 s，复性55℃、30 s，延伸72℃、30 s，将变性、复性和延伸循环30次后，再延伸70℃、5 min，最后4℃保存产品。配制2%的琼脂糖凝胶，用水平电泳仪进行电泳40 min后，紫外下扫描照相后，检测吸光度值，进行结果统计分析。
1.3 统计方法
应用SPSS11.0软件对数据进行分析，计数资料用率表示，行χ2检验。
2 结果
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两组数据比较，阳性率行χ2检验，χ2 =6.17，P=0.034，P<0.05，说明经处理差异有统计学意义，见表1。
表1 对照组与PCR组检测结果对比[n(%)]
3 讨论
肺癌是发病率较高的呼吸系统肿瘤疾病，其发病率和死亡率逐年急剧上升，并且该病的发病率和死亡率具有性别差异，其中男性患者的发病率和死亡率位居恶性肿瘤的榜首，女性患者的发病率和死亡率位居恶性肿瘤的第二位[5]，但具有较低治愈率和较高致死率的特点，对人类生命健康造成严重威胁。目前，肺癌的发病原因还没有得到明确阐述，有大量研究资料表明[6]：该病可能与吸烟、环境有重大联系，其中不吸烟的肺癌患者占吸烟肺癌患者的1/10～1/20，并且年龄越小就开始吸烟越容易患有肺癌，城市居民患有肺癌的几率比农村的患者高，其主要原因是城市大气污染要比农村更为严重。肺癌的发病原因主要是吸烟、电离辐射、职业与环境接触、大气污染、遗传因素和既往肺部慢性感染，其中吸烟是最严重的肺癌高危因素，而职业癌是常见的肺癌疾病。肺癌具有直接扩散、血行转移和淋巴道转移三种播散转移方式，其中淋巴道转移是最常见的肺癌转移方式。肺癌的临床表现主要包括局部症状、全身症状、肺外症状、侵润和转移症状，其中局部症状有咳嗽、胸痛、胸闷、气急、咯血和声音嘶哑，而咳嗽是最常见的局部症状，也是肺癌的首发症状。p16基因又称为MTS1基因，于1994年被Kamb等发现的一种新的抗癌基因，它是细胞周期中的一种基本基因，其作用是直接参与细胞周期的调控，对细胞增殖和分裂进行负调节[7]。目前，经研究发现人类肿瘤细胞的p16基因有一半会发生纯合性缺失和突变，因此被称为细胞周期的刹车装置，一旦失灵，则细胞会出现恶性增殖，最终导致恶性肿瘤的发生[8]。近几年，临床研究发现，在肺癌、乳腺癌、骨肿瘤、皮肤癌、膀胱癌、脑肿瘤、肾癌、卵巢癌和淋巴瘤等癌细胞中p16基因出现纯合性缺失和突变等现象，证明了p16基因通过缺失和突变的形式，参与了肿瘤的形成。因此在肿瘤患者的易感性和预后方面，对p16基因进行纯合性缺失的检测具有重要的临床意义[9-11]。由于胸水收集方便，该院将肺癌所致胸膜转移后的胸水标本作为研究对象，结果表明，PCR组88例肺癌所致癌性胸水患者的标本中没有出现1例p16基因第一外显子纯合性缺失，但是有35例p16基因第二外显子纯合性缺失，其阳性率为39.77%；对照组88例肺癌所致癌性胸水患者的标本中有52例出现胸水脱落细胞血阳性结果，其阳性率为59.09%。胸水细胞学检测是一种特异性检查手段，病理状态下，在胸水形成的同时，胸膜间皮细胞和恶性肿瘤细胞都会脱落至胸水中，因此可以通过胸水脱落细胞学的检测来诊断疾病。p16基因的编码蛋白是细胞周期素D和依赖性激酶的特异性抑制剂，其抑制肿瘤的机制是通过抑制细胞周期进程而抑制细胞增殖[12-13]。绝大多数肿瘤中存在p16 基因的缺失或突变，并且纯合性缺失发生的频率更高，而且主要发生于第二外显子上，经叶玉坤等研究发现在肺癌组织p16 基因的表达率要远远低于癌组织旁边的正常组织和良性肿瘤的表达率，且表达率的高低与临床分期密切相关，尤其是在Ⅰ期和Ⅱ期肺癌中，p16 基因的纯合性缺失率达到30%以上，并且是非小细胞肺癌[3]。因此，将p16基因作为肺癌治疗的靶基因具有可行性，同时胸水p16基因纯合性缺失的检测方法不仅方便，而且准确率高，可以作为癌症检测和预后的重要辅助手段，值得临床推广。, 百拇医药(于薇)