结直肠癌组织和静脉血中KRAS基因突变分析及临床意义(2)
1.2 实验方法
1.2.1 血浆DNA提取 DNA抽提试剂盒(纯化柱式)购自碧云天生物技术研究所。复温后向Ep管中加入PBS缓冲溶液涡旋摇散沉淀至絮状，加蛋白酶K、裂解液B涡旋混匀，置于70 ℃恒温箱中10 min后加无水乙醇混匀转入DNA纯化柱中置于废液收集管上离心。向纯化柱内先后加入洗涤液Ⅰ、Ⅱ及空离一次水浴后。将DNA纯化柱转入标记好的Ep管中放入-20 ℃冰箱保存待用。
1.2.2 组织DNA提取 采用碧云天生物技术公司的DNA提取试剂盒。对组织标本切8 μm厚10张，切取4 μm厚1张HE染色镜下观察肿瘤细胞集中区域，将切片对应归入EP管中脱蜡醇化，加入裂解液55 ℃水浴过夜，蛋白酶K消化，沉淀洗盐，-20 ℃冰箱保存备用，取样本行纯度测定稀释后行PCR检测。
1.2.3 PCR扩增纯化 由上海碧云天生物技术有限公司利用软件Premier 5.0设计PCR引物序列如下：KRAS基因第2号外显子：上游引物5’-GTCGATATAGTTTGTAAATGAAGT-3’下游引物5’-CAGCTAAATTAAACATTTACTTC-3’扩增片段长度为178 bp ......
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1.2.1 血浆DNA提取 DNA抽提试剂盒(纯化柱式)购自碧云天生物技术研究所。复温后向Ep管中加入PBS缓冲溶液涡旋摇散沉淀至絮状，加蛋白酶K、裂解液B涡旋混匀，置于70 ℃恒温箱中10 min后加无水乙醇混匀转入DNA纯化柱中置于废液收集管上离心。向纯化柱内先后加入洗涤液Ⅰ、Ⅱ及空离一次水浴后。将DNA纯化柱转入标记好的Ep管中放入-20 ℃冰箱保存待用。
1.2.2 组织DNA提取 采用碧云天生物技术公司的DNA提取试剂盒。对组织标本切8 μm厚10张，切取4 μm厚1张HE染色镜下观察肿瘤细胞集中区域，将切片对应归入EP管中脱蜡醇化，加入裂解液55 ℃水浴过夜，蛋白酶K消化，沉淀洗盐，-20 ℃冰箱保存备用，取样本行纯度测定稀释后行PCR检测。
1.2.3 PCR扩增纯化 由上海碧云天生物技术有限公司利用软件Premier 5.0设计PCR引物序列如下：KRAS基因第2号外显子：上游引物5’-GTCGATATAGTTTGTAAATGAAGT-3’下游引物5’-CAGCTAAATTAAACATTTACTTC-3’扩增片段长度为178 bp ......
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