刘晓玲，郭红月，董 猛，宋振川

    (河北省沧州中西医结合医院，河北沧州061001)

    树突状细胞(dendritic cell，DC)是抗原递呈细胞(antigen-presenting cell，APC)，也是唯一能将抗原递呈给初始T细胞激发初次免疫应答的抗原呈提细胞，被认为是机体免疫的始动者，在抗肿瘤免疫方面发挥着重要作用，基于DC的免疫治疗被认为是最具前景的抗肿瘤治疗[1]，本研究采用简便方法体外分离培养扩增小鼠骨髓DCs，为抗肿瘤疫苗的实验研究奠定基础。

    1 材料与方法

    1.1 材料

    SPF级615小鼠，雌雄各半，鼠龄6～8周龄，体重17～21g，购于天津中国医学科学院血液研究所实验动物中心。胎牛血清(杭州四季青生物有限公司)、RPMI1640培养基(美国GIBICO公司)、PBS粉(北京中杉金桥生物技术有限公司)rmIl-4、rmGMCSF、rmTNF-α、FITC 标记抗鼠单克隆抗体、PE 标记抗鼠CD86单克隆抗体均购于美国BioLegend公司。CO2培养箱(美国 SHELDON)、流式细胞仪(美国Beckman Coulter公司)、倒置显微镜(日本OLYMPUS)。

    1.2 实验方法

    1.2.1 小鼠骨髓单核细胞分离 将615小鼠拉颈处死，浸入75%酒精消毒5min，无菌状态下取胫骨和股骨，剪掉股骨和胫骨骨两端，用1ml一次性使用注射器抽取PBS液，刺入骨髓腔反复冲洗，骨髓细胞悬液过400目滤网去除组织碎片，收集细胞悬液离心(1 500r/min，5min)，弃上清，以1∶10体积比加入37℃预温的红细胞裂解液重悬使红细胞裂解，同法PBS液离心清洗2次。

    1.2.2 骨髓源树突状细胞(BMDC)的培养扩增用全培养基悬浮细胞，细胞计数，以RMPI-1640全培养液配成2×106个/ml的细胞悬液，接种于6孔板，每孔中加入完全培养基至4ml，再加入GM-CSF(终质量浓度20ng/ml)，置于37℃、5%CO2培养箱中进行培养。第3天轻轻吹打，吸去培养液和悬浮细胞，保留贴壁细胞加入新鲜的等量RMPI-1640全培养液和相同浓度的GM-CSF及终浓度为10ng/ml的IL-4，继续培养，隔日半量换液，补充RMPI-1640全培养液和GM-CSF及IL-4。继续培养至第8天，加入TNF-α(10ng/ml)，孵育48小时收集悬浮细胞即为成熟的DCs。

    1.2.3 细胞生长状态观察 每天相差显微镜下观察DC的形态、数量、分布、贴壁情况、细胞集落生长情况并拍照 ......