吴 进，刘庆军，曾文容，吴采荣，戴立林，陈志达

    (厦门大学附属东南医院骨科， 福建 漳州 363000)

    应用基础研究?

    沉默Ether à go-go 1基因调控VEGF/PI3K/AKT抑制骨肉瘤增殖和血管生成的研究*

    吴 进，刘庆军，曾文容，吴采荣，戴立林，陈志达△

    (厦门大学附属东南医院骨科， 福建 漳州 363000)

    目的：检测沉默Ether à go-go 1 (Eag1) 基因对骨肉瘤增殖和血管生成的影响及其可能的调控机制。方法： 构建抑制Eag1表达的短发卡RNA (short hair RNA, shRNA) 重组腺病毒载体Ad5-Eag1-shRNA并感染骨肉瘤细胞株。采用实时定量聚合酶链反应 (real-time polymerase chain reaction, Real-time PCR) 和蛋白印迹技术 (Western blot analysis, WB) 检测Ad5-Eag1-shRNA的感染效能。采用CCK-8法和裸鼠成瘤实验检测感染前后骨肉瘤细胞增殖和裸鼠骨肉瘤体积的变化。采用免疫组化技术和WB技术分别检测感染前后裸鼠肿瘤组织中微血管密度 (microvessel density, MVD) 和血管内皮生长因子 (vascular endothelial growth factor, VEGF) 表达的变化。采用WB技术检测感染前后骨肉瘤细胞中VEGF、磷脂酰肌醇3-激酶 (phosphoinositide 3-kinase, PI3K) 和蛋白激酶B (protein kinase B, AKT) 的表达变化。结果： 构建的重组腺病毒载体Ad5-Eag1-shRNA具有良好的感染效能。感染Ad5-Eag1-shRNA可沉默骨肉瘤中Eag1的表达并能有效地抑制骨肉瘤细胞增殖和裸鼠骨肉瘤生长 (均P1 材料与方法

    1.1 实验动物、材料、试剂及仪器

    实验动物：无胸腺的BALB/c的雌性裸鼠 (鼠龄4～6周) 购买自厦门大学动物实验中心。细胞：人骨肉瘤细胞MG-63细胞和人源胚胎肾293细胞 (HEK293)购自美国ATCC公司。主要试剂：RPMI-1640培养基和胎牛血清购买自美国Gibco公司，细胞裂解液购买自美国Invitrogen公司，pGeneSil-1质粒和免疫组化试剂盒购买自武汉赛晶公司，反转录试剂盒购买自日本Takara公司，CCK-8试剂盒购买自美国Dojindo公司，琼脂糖购买自美国Sigma公司，Eag1、血管内皮生长因子 (vascular endothelial growth factor, VEGF)、磷酸化的磷脂酰肌醇3-激酶(phospho-phosphoinositide 3-kinase, p-PI3K)、磷酸化的蛋白激酶B (phospho-protein kinase B, p-AKT)、总的PI3K (total-PI3K, t-PI3K)、总的AKT (total-AKT, t-AKT)、GAPDH和其他相关抗体购买自英国Abcam公司 ......