张冉浠，周莉，陆安伟，秦娟

    550004 贵阳，贵州医科大学 临床医学院(张冉浠、秦娟)；550004 贵阳, 贵阳市妇幼保健院 妇科肿瘤科(周莉、秦娟)；518000 广东 深圳，南方医科大学深圳医院 妇科(陆安伟)

    宫颈癌是全球女性死亡的主要原因之一。顺铂通过损伤细胞DNA用于宫颈癌的化疗。但顺铂化疗的敏感性问题亟需解决。葡萄糖调节蛋白78(glucose regulated protein 78,GRP78)是内质网上的一个主要应激介导蛋白，既往认为GRP78表达水平与宫颈癌发生、发展有关[1]。已有研究发现内质网应激反应(endoplasmic reticulum stress,ERS)可降低P53突变肺癌细胞对顺铂的化疗耐受[2]。目前已知GRP78在卵巢肿瘤细胞中有抗顺铂耐药作用[3]。但GRP78与人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)相关宫颈癌细胞对顺铂敏感性之间的关系尚不明确。本试验拟探讨不同HPV亚型宫颈癌细胞GRP78表达水平的差异；通过不同浓度顺铂处理后，对比内质网激活剂衣霉素联合顺铂处理后，宫颈癌细胞对顺铂的敏感性及GRP78的表达水平变化，了解ERS与宫颈癌顺铂耐药间的关系，寻找宫颈癌治疗的新的方向。

    1 材料与方法

    1.1 材料

    1.1.1 人宫颈癌细胞株 SiHa(HPV16+)、HeLa(HPV18+)及C33a(HPV-)购自上海中乔新舟生物科技有限公司。

    1.1.2 试剂 DMEM培养基、胰酶、胎牛血清、GRP78(兔抗人)一抗、二抗：羊抗兔IgG、顺铂、衣霉素、细胞全蛋白抽提试剂盒、聚氰基丙烯酸正丁酯(butyleyanoacrylate,BCA)蛋白定量试剂盒。

    1.2 主要方法

    1.2.1 细胞株培养 培养于含有10%胎牛血清及1%双抗的高糖DMEM培养液中，于37℃5%CO2培养箱中培养，细胞密度约为5×105个/mL时进行后续实验。

    1.2.2 免疫组织化学法 取3种细胞的细胞爬片各一张，磷酸缓冲盐溶液冲洗，加入4%多聚甲醛、一抗(GRP78抗体，稀释倍数1∶100)，湿盒、4℃孵育过夜。二抗处理后二氨基联苯胺显色、苏木素复染。显微镜下观察：阳性染色细胞浆或胞核呈黄色，用IPP 6.0软件进行阳性着色细胞计数。阳性细胞表达率=阳性细胞数/细胞总数×100%[4]。

    1.2.3 药物处理 将HeLa、SiHa、C33a细胞株各自分为3组 ......