屈岭 梁晓春 顾蓓 张宏 石玥

    糖尿病周围神经病变发病机制尚未阐明，尚缺乏有效治疗手段[1-2]。槲皮素广泛存在于多种中药和食物中，具有抗氧化、清除自由基等作用。有学者发现槲皮素可增加被高浓度葡萄糖所抑制的神经细胞的增殖活性，减少氧化应激损伤，并可通过诱导自噬而减少凋亡[3-5]。本研究通过离体实验观察了槲皮素对高浓度葡萄糖培养雪旺细胞中增殖活性、凋亡与自噬变化规律的影响，来了解槲皮素是否通过自噬—凋亡途径对糖尿病周围神经病变起到防治作用。

    1 材料和方法

    1.1 材料

    1.1.1 实验细胞 大鼠雪旺细胞系细胞(rat Schwann cell line，RSC96)，一种永生化的大鼠雪旺细胞，购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。

    1.1.2 药品试剂 槲皮素、噻唑基四唑(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)、3-甲基嘌呤(3-methyladenine，3-MA)(Sigma，美国);改良Eagle培养基(Dulbecco's modification of Eagle's medium，DMEM)(Gibco，美国);兔抗大鼠caspase-3 多克隆抗体、兔抗大鼠caspase-9 多克隆抗体(Santa Cruz，美国);原位末端标记法(terminal dexynucleotidyl transferase(TdT)-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL)试剂盒(Roche，美国)。

    1.1.3 实验仪器 CO2培养箱(Forma 3111，美国);高速低温离心机(ALC PK121R，美国);倒置相差显微镜(Olympus CKX31SF，日本);激光扫描共聚焦显微镜(LEⅠCA TCS SP2SE，德国);透射电子显微镜(JEM 1010，日本)。

    1.2 实验方法

    1.2.1 细胞培养 复苏RSC96 细胞，加入DMEM培养基、胎牛血清(10%)、谷氨酰胺(终浓度4 mmol/L)、丙酮酸钠(终浓度1 mmol/L)、HEPES(终浓度12.5 mmol/L)，2 ～3 天换液1 次。

    1.2.2 TUNEL 检测 作用72 小时后，4%多聚甲醛固定样本1 小时(室温下);0.1%TritionX-100 孵育3 分钟;阳性对照组:滴加脱氧核糖核酸酶Ⅰ后，室温下孵育10 分钟，滴加TUNEL 反应液，阴性对照组滴加试剂2，避光，37℃ ......