结核分枝杆菌耐药性不同检测方法的比较与评价
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[摘要] 目的：探讨两种方法在结核分枝杆菌耐药性快速检测的应用可行性。方法：应用直接法与传统法进行耐药试验，比较两者的耐药结果。结果：与传统法耐药管培养结果比较，涂片≤2+的痰标本的低浓度耐药试验直接法的结果RFP、INH、EMB耐药性符合率分别为28.6%、50.0%、12.5%，耐药性总符合率为30.4%，两者差异有统计学意义。结论：直接法应用于结核分枝杆菌耐药试验是可行的，对临床上肺结核病人耐药性的快速检测具有一定价值。
[关键词] 结核分枝杆菌；肺结核；直接耐药试验；耐药性检测
[中图分类号]R378.91+1 [文献标识码]B [文章编号]1674-4721(2009)02(a)-021-01
结核分枝杆菌高耐药是结核病病情恶化的重要原因，已成为当前结核病临床和防治工作的难题。常规药敏试验方法，如用罗氏培养基等做直接或间接药敏试验，由于受MTB生长缓慢的影响而费力、费时(需6～8周或更长时间)，不能满足临床需要，目前已较少使用。故目前急需一种简单、快速、价廉、灵敏、特异的检查方法。为了指导临床用药，本文实际比较了结核分枝杆菌耐药性不同检测方法的效果，现报道如下：
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1材料与方法
1.1材料
结核分枝杆菌共35株(份)，均自我院住院和门诊患者的痰、胸腔积液、腹腔积液等标本中分离，经对硝基苯甲酸(PNB)噻吩，2-羧酸肼(TCH)鉴别培养基培养鉴定为结核分枝杆菌。痰标本处理按规定要求进行痰标本处理[1]。
1.2检测方法
直接法：取经前处理的标本液0.1 ml，均匀接种于各培养基斜面上，每份标本按每个药物浓度管2支，不含药物的对照管2支、分离培养管2支进行接种。接种后放37℃孵箱培养，2周内每天观察1次，2周后每周观察1次，药敏试验管至4周报告药敏结果。传统法：取上述直接法分离培养基上生长的菌落，采用传统法进行药敏试验。按传统规定药敏试验结果观察报告结果。
1.3耐药判定标准
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以含药培养基无菌落生长者报告敏感(S)，有菌落生长≥20个者报告耐药(R)。
2结果
2.1痰涂片结果
直接法培养的对照管有菌落生长的共34例，占97.1%，其中结果报告3+以上的有25例，2+及以下的有8例，阴性的1例。以直接法对照管培养结果与传统法对照管培养结果比较，涂片≤2+，对照管培养结果≥3+的标本的符合率为52.5%；涂片≥3+，对照管结果≥3+的痰标本的符合率为100%。
2.3耐药性结果
与传统法药敏管培养结果比较，涂片≤2+的痰标本的低浓度药敏试验直接法的结果RFP、INH、EMB耐药性符合率分别为28.6% 、50.0% 、12.5%，耐药性总符合率为30.4%，两者差异有统计学意义。见表1。
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3讨论
随着分子生物学诊断技术的进展，抗结核药物的耐药机制逐渐被阐明[2]。利福平(RFP)通过特异地与依赖DNA的RNA聚合酶β亚单位(rpoβ)结合，抑制RNA聚合酶活性，从而干扰mRNA的转录，阻碍蛋白质的合成而发挥抗菌作用。当rpoβ基因发生一个或多个位点的突变、缺失时，就会对RFP产生耐药。95%左右的RFP耐药菌株的产生都是由于rpoβ基因发生改变所致。
检测耐药性主要包括绝对浓度法、抗性比率法和比例法[3]。但以往使用的方法都较费时，不能准确定量，只能对结核分枝杆菌培养物进行分析。近几年改良的直接法用于检测的同时，也被用于耐药性检测。为了加快实验进程，对那些涂片经抗酸染色检查阳性的标本可直接进行药敏试验，只需7～14 d即可得到结果，且可较准确定量。本文直接法的对照管、耐药管培养结果与传统法相应的培养管的培养结果比较显示涂片含菌量≥3+的痰标本，两者的培养结果非常相符，两者的对照管培养结果≥3+符合率为100%，而涂片含菌量≤2+的痰标本，两者的培养结果的相符性较差，两者差异有统计学意义。
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同时随着科学技术方法的发展，PCR技术已大量应用与检测耐药性，PCR技术最初仅限于对临床痰标本中的结核分枝杆菌进行检测，根据结核分枝杆菌特有的扩增目标包括插入和重复序列、各种蛋白编码基因和核糖体RNA等设计特异引物，最后根据扩增出的目的片段来判断阳性结果。PCR技术的应用无疑大大缩短了实验周期，且操作简便，但是单纯通过扩增产物在凝胶板上的迁移判定扩增的阳性与否还是不够可靠，同时由于扩增抑制物亦存在有假阴性结果。实际上，即使片段长度的等同也不应认为扩增产物就是目的片段，而应在片段长度和序列同源性两个方面同时得到确认。
[参考文献]
[1]中国防痨协会.结核病诊断细菌学检验规程[J].中国防痨杂志,1996,18(1):28.
[2]王书杭，李养群，牛国强.住院肺结核患者初治耐药动态监测[J].临床肺科杂志，2006，11(2)：239-241.
[3]黄小玲，罗道泉，欧阳资章，等.深圳市抗肺结核药物的耐药评价[J].中国药房，2005，16(14)：1084-1085.
(收稿日期：2008-11-25), 百拇医药(贺素典 郭继丰)