鼠抗人p21、p27、bcl-2单克隆抗体、抗体稀释液及试剂盒均购自基因公司。p21稀释度为1∶50，P27、bcl-2稀释度为1∶200。所有标本均用10 %中性甲醛固定,石蜡包埋,4 μm 连续切片,按二步法法进行免疫组化染色,染色前标本切片进行抗原修复处理，一抗在室温孵育1 h，二抗在室温下孵育0.5 h，DAB 显色，苏木素复染。用已知阳性的大肠癌标本作p21、p27、bcl-2抗体的阳性对照，用PBS缓冲液代替一抗作阴性对照。

    1.3判断标准

    所有免疫组化片子用奥林帕斯BX50显微镜进行定性和半定量评估。请3个高职称病理医生在不知道临床信息的情况下独立的对所有免疫组化片子进行评估。阳性判断标准为细胞核、细胞浆和(或)细胞膜出现了黄色或棕黄色颗粒状,并用阳性片作为对照。每张切片随机选择10个视野,40×10 高倍显微镜下观察计数。

    p21参照文献[1]方法根据染色的强度及阳性细胞的数量分别记分。A :染色强度，不着色为0 分,淡黄色为1 分,黄色为2 分,棕黄色为3 分。B :阳性细胞所占百分率，<5%为0分，5%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，>75%为4分。根据染色强度与阳性细胞数得分之和分为4级,即(-)为0分,弱阳性( + )为1～2分,阳性(++)为3～4分,强阳性(+++)为5～6分 ......