雷诺嗪有关物质及其含量的HPLC快速测定
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[摘要]目的：建立雷诺嗪有关物质及其含量的HPLC测定方法。方法：以YMC—Pack ODS-A C18 (4.6 mm×l50.O mm，5μm)为色谱柱；流动相为0.05 mol/L磷酸二氢钾缓冲溶液(含0.2%的三乙胺)—乙腈(48：52)；流速为1.0 ml/min；进样量为10 μl；检测波长为215 nm。结果：在0.06-150μg/ml浓度范围内呈良好的线性关系，相关系数1=0.999 9，日内精密度RSD为0.61%，日间精密度RSD为1.40%(n=6)；平均回收率为100.5%，RSD为1.3%(n=9)。结论：本文所建立的方法，简便、重现性好、准确度高，可适用于雷诺嗪及其有关物质的含量测定。
[关键词]雷诺嗪；高效液相色谱法；含量测定；有关物质
[中图分类号1 R927，2
[文献标识码]A
[文章编号]1674-4721(2009)03(b)-012-02
心绞痛是冠心病中常见的一类心血管疾病，用于治疗心绞痛的传统药物副作用较大，尤其是对心脏的损害，因此，人们一直致力于寻找更有效、副作用少的新药和新的治疗途径来改善心肌缺血。一种晚钠离子电流选择性阻滞剂雷诺嗪于2006年由Roche公司在美国正式上市。它是唯一的不引起心率、血压改变的抗心绞痛药，与其他抗心绞痛药联合应用，也不产生相加作用。从而避免心脏功能进一步受损害，能提高心绞痛患者的生活质量，具有很好的应用前景。目前雷诺嗪的测定方法有非水滴定法、紫外分光光度法和高效液相色谱法：《中华人民共和国药典》2005年版也没有雷诺嗪的相关记载。本文采用反相高效液相色谱法，尝试了不同的色谱分离条件，建立了雷诺嗪及其有关物质含量测定方法，并对方法的专属性和重现性等进行了考察。
1实验仪器与药品
1.1仪器
Agilent HP1100高效液相色谱仪，G1311A四元梯度洗脱泵(在线脱气)；G1316A恒温柱温箱；G1315ADAD检测器；Chemstation色谱工作站。
1.2药品
雷诺嗪对照品(由原料样品用甲醇重结晶5次后进行精制得到，HPLC检查，含量为99.7%)；雷诺嗪原料药(河南省天方药业有限公司提供，批号：030600010，030600020，030600030)；乙腈(色谱纯)；水为二次蒸馏水；其余试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1色谱条件
色谱柱：YMC—Pack ODS-A C18；流动相：0.05 mol/L磷酸二氢钾缓冲溶液(含0.2%的三乙胺)：乙腈=48：52(V/V)；流速：1.0 ml/min；检测波长215 nm；进样量：10μl。在此色谱条件下，色谱柱的理论塔板数按雷诺嗪计算应不低于3 000。峰型对称尖锐，主峰的保留时间约为6.0 min。
2.2检测波长的确定和专属性实验
按照中国药典方法对雷诺嗪供试品溶液进行酸性、碱性、氧化、高热和光照的破坏试验。然后取雷诺嗪对照品溶液、酸破坏样品溶液、碱破坏样品溶液、光照降解样品溶液、高温降解样品溶液、氧化降解样品溶液各10μl，分别注入液相色谱仪并用DAD检测器扫描。经扫描发现，有关物质在215 am波长处吸收较强，同时又避开了末端吸收，故选择215 nm作为有关物质的检测波长。在该色谱条件下主峰保留时间Rt=6.02 min，雷诺嗪在上述破坏性试验中所产生的降解产物的色谱峰与主谱峰完全分离，因此该方法可以用于有关物质的测定。
2.3标准曲线
取雷诺嗪对照品150mg，精密称定，置25 ml的量瓶中，加流动相溶解并稀释定容至刻度，摇匀，制得浓度为6.0 mg/ml的对照品溶液。再依次将该溶液稀释，用流动相定容至刻度，制成系列溶液，按上述色谱条件，精密量取系列溶液10μl注入色谱仪，记录色谱图。以得到的峰面积A与浓度c进行线性回归，回归方程为：
A=9.452 3C-0.221 9 r=0.999 9
结果表明雷诺嗪浓度在0.06～150.00μg/ml范围内呈良好的线性关系。
2.4最低检出限
取雷诺嗪对照品溶液用流动相稀释，将灵敏度调至最大，精密量取一定量注入液相色谱仪，量取峰商，按峰高约为基线噪音的三倍得出雷诺嗪的最低检出限为10 ng。
2.5稳定性考察
精密称定本品(030600020)适量于100ml量瓶中，加流动相40 ml后使其完全溶解，用流动相稀释至刻度，摇匀，即得(30 μg/ml)，作为供试品溶液，进行稳定性考察。室温放置0、6、12 h后。按以上色谱条件进样记录色谱图，测定峰面积，结果显示供试品溶液的峰面积基本一致(RSD=0.54%)，说明溶液在室温下12 h内稳定。
2.6精密度试验
取供试品溶液(30μg/ml)，在上述色谱条件下同一日内重复进样6次，记录峰面积，计算日内RSD=0.61%(n=6)。取同样浓度样品，在相同的色谱条件下每间隔24小时进样，连续测量6 d，计算日间RSD%=1.4%(n=6)。结果表明本方法精密度良好。
2.7回收率试验
取雷诺嗪供试品溶液高、中、低三种浓度各3份进行回收率实验。
2.8样品测定
分别精密称定雷诺嗪3批样品适量于100Ⅱ1l量瓶中，加流动相40ml后使其完全溶解，用流动相稀释至刻度，摇匀，制得30μg/ml的溶液，作为供试品溶液，精密量取供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，另称取雷诺嗪对照品适量同法操作。分别按外标法以峰面积计算，结果3批样品的含量均不小于99.5%。
2.9有关物质含量测定
分别精密称定3批样品2.5 mg于50 ml量瓶中，加流动，相40ml后使完全溶解，用流动相稀释至刻度，摇匀，即得供试溶液。再量取供试品溶液1 ml，用流动相稀释至100 ml作为1%的对照溶液。精密移取1%对照溶液10μl注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分峰为满量程的20%～25%。再精密量取供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的2倍。供试品溶液色谱图中如显杂质峰，量取各杂质峰面积之和 ......
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