新生大鼠缺氧缺血性脑损伤AQP-4表达及依达拉奉治疗效果的研究(2)
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将各时间点脑组织分别置于电子天平称湿重(精确到0.1 mg),然后置于100℃恒温烘箱24 h称干重。按Elliot公式,含水量=(湿重-干重)/湿重×100%。
1.5 HE染色
常规石蜡切片-二甲苯脱蜡-梯度酒精脱水-苏木素,伊红染色-二甲苯透明-中性树胶封片-显微镜下观察。
1.6 免疫组化
切片常规脱蜡至水,3%H2O2室温孵育15 min;枸橼酸缓冲液中抗原修复2 min;滴加封闭用正常山羊血清工作液,室温中孵育20 min;滴加一抗AQP-4(1:200),湿盒置于4℃冰箱中过夜,PBS液洗2 min/次×3次;滴加生物素化二抗,室温下孵育15 min,PBS液洗2 min/次×3次;滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液(S-A/HRP),室温下孵育15 min,PBS液洗2 min/次×3次;用DAB显色剂显色(镜下观察显色程度),自来水终止;苏木素复染、脱水、透明、中性树胶封片。阴性对照切片用PBS液代替一抗,余步骤相同。
1.7 图像分析
采用BI-2000医学图像分析系统(成都泰盟科技有限公司)进行图像采集与分析,在相同光亮强度和放大倍数(10×40)条件下统计阳性细胞平均灰度值,每只鼠3张片子,每张片子取4个视野,算出其均数进行比较与分析。
1.8 统计学分析
数据以x±s表示,用SPSS13.0统计软件进行单因素方差分析,两两比较采用SNK-q检验,P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 脑组织含水量结果
HIBD组脑组织含水量在术后6 h开始升高(P<0.05),3 d达高峰。治疗组各时间点与HIBD组比较,差异有统计学意义(P<0.01)。结果见表1。
2.2 脑组织病理学观察
与对照组比较,HIBD组脑回增宽、脑沟变浅。HIBD后6 h～3 d为逐渐加重的细胞内水肿,到第3天脑水肿进一步加剧,少量神经元和胶质细胞坏死、崩解;5、7 d组脑组织肿胀明显好转,偶见软化灶。经依达拉奉治疗后,各时间点星形胶质细胞水肿减轻,仅见斑点状神经元坏死。
2.3 免疫组织化学结果
AQP-4在各组大鼠脑组织中均有表达,阳性表达主要见于室管膜、软脑膜及血管周围的星形胶质细胞上。HIBD组病灶周围水肿区星形胶质细胞AQP-4表达较假手术组增高,以3 d为著。治疗组在24 h、3、5、7 d与模型组比较,差异有统计学意义(P<0.01)。结果见表2。
3 讨论
近年来研究发现水通道蛋白4(AQP-4)广泛分布于脑组织,主要分布于脑表面的软脑膜,脑室系统的室管膜,靠近蛛网膜下腔和位于血管周围的星形胶质细胞[7]。AQP-4在脑内的广泛分布可能是脑脊液重吸收、渗透压调节、脑水肿形成等生理、病理过程的分子生物学基础。Taniguchi等[8]发现缺氧缺血第1天AQP-4mRNA的表达弱上调,第3天达高峰,持续7 d左右减少,这种变化与MRI显示的脑水肿形成和消散相一致,说明AQP-4在缺氧缺血性脑水肿的发生发展过程中起重要作用。但脑内AQP-4表达的调节机制尚不十分清楚,目前研究最多的是蛋白激酶C(PKC)通过磷酸化调节AQP-4的活性[9]。
本实验结果显示AQP-4的表达在HIBD后6 h开始升高,24 h后明显增加,3 d达高峰,随后逐渐下降,且与脑组织含水量的变化一致。该结果提示AQP-4表达的上调导致脑含水量的增加,说明AOP-4参与了HIBD后脑水肿的发生发展过程,因此通过调控AQP-4表达可能为减轻脑水肿提供新的治疗方法。
近年来氧自由基损伤在新生儿HIE病理生理过程中的作用越来越受到重视,神经细胞膜含有高密度不饱和脂肪酸,极易遭受自由基损伤,引起脂质过氧化反应,破坏细胞膜,损伤细胞完整性,最终造成广泛损伤产生脑水肿。自由基还可导致脑组织微血管内皮细胞坏死,引起脑血管通透性增加,进一步加重脑水肿[10-11]。
依达拉奉(edaravone)是一种新型的自由基清除剂,在日本已经被批准广泛运用于成人急性脑梗死的治疗[11]。依达拉奉可捕获羟自由基,许多对脑缺血动物模型的体内研究表明,该药可减轻脑缺血引起的脑水肿及组织损伤。本研究观察到依达拉奉可以明显降低HIBD后各时间点脑组织含水量及AQP-4的表达,自由基上调AOP-4的机制可能是激活了PKC磷酸化途径,AQP-4在磷酸化状态时,膜对水的转运远大于非磷酸化状态,从而加重膜对水的通透性。依达拉奉通过打断自由基的连锁反应,间接抑制AQP-4的表达,进一步减轻脑水肿的形成及加剧。
综上所述,AQP-4表达增高与HIBD后脑水肿的严重程度呈正相关,而依达拉奉通过间接抑制AQP-4的表达减轻缺氧缺血后引起的脑水肿,从而达到其脑保护作用,为其在新生儿HIE的临床运用提供了理论依据。但对于该药用于防治新生儿HIE的剂量、用药时机及其可能产生的副作用还需进一步研究。
[参考文献]
[1]Manley GT,Fujimura M,Ma T,et al.Aquaporin-4 deletion in mice reduces brain edema after acute water toxication and ischemic stroke[J].Nat Med,2000,6(2):159-163.
[2]Wu TW,Zheng LH,Wu J,et al. MCL 86 further histochemical and biochemical evidence of neuroprotection[J].Life Sci,2000,67:2387.
[3]Otomo E.Effect of a novel free radical scavenger, edarevone(MCI 186),on acute brain infarction[J].Cerebrovasc Dis,2003,15(3):222.
[4]Jin YJ,Mima T,Raicu V,et al.Combined argatroban and edravone caused additive neuroprotection against 15 min of forebrain ischemia in gerbils[J].Neurosci Res,2002,43(1):75 ......
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