套式PCR检测非淋球菌性尿道炎中生殖支原体和解脲支原体
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2010年3月5日
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[摘要] 目的:采用nPCR技术,对在本院确诊的非淋球菌性尿道炎(NGU)患者的泌尿生殖道分泌物标本进行检测,以探讨套式PCR(nPCR)技术在生殖支原体(Mg)和解脲支原体(Uu)检测中的作用和地位。方法:深圳市福田区NGU患者98例,宫颈或尿道口内拭子分泌物标本用nPCR进行DNA扩增,并与对照组43例进行比较。结果:98例标本中Mg阳性15例,阳性率为15.3%,正常对照组无一例阳性。Uu阳性21例,阳性率为21.4%,对照组仅1例阳性。结论:深圳福田区Mg、Uu在NGU中具有较高的感染率,nPCR具有敏感、快速、特异性强等特点,可用于临床辅助诊断和流行病学调查。
[关键词] 生殖支原体;解脲支原体;套式PCR;非淋球菌性尿道炎
[中图分类号] R375 [文献标识码]B [文章编号]1674-4721(2010)03(a)-069-02
生殖支原体(Mg)和解脲支原体(Uu)是引起非淋球菌性尿道炎(NGU)的主要病原体之一,由于其培养费时且敏感性低,严重阻碍了其在临床诊断中的研究[1],自PCR技术问世以来,基因诊断已经成为支原体感染较为理想的诊断方法。因PCR仅需少量标本,且无需提纯标本DNA(简单裂解即可),检测的灵敏度和特异性均大于DNA探针杂交法,因此得到了迅速的推广和应用[2]。为了进一步探讨套式PCR(nPCR)在临床诊断中的应用价值,笔者应用nPCR检测了2005～2007年来本院就诊的98例NGU患者,现将初步结果报道如下:
1 资料与方法
1.1 标本来源
2005～2007年从深圳市福田区中医院皮肤性病科门诊临床诊断为NGU的患者98例,其中,男性61例(19～56岁),女性37例(17～49岁),有性乱史者41例,受检者均在15 d内未用过抗衣原体、支原体药物。正常对照组43例,男21例,女22例,年龄19～30岁,均为体检或门诊就诊孕妇。
1.2 取材方法
标本采集用无菌棉拭子,男性插入尿道2～3 cm,女性插入宫颈内1～2 cm,置留20～30 s,并旋转3圈后取出,置-20℃温度下备用。
1.3 标本处理
样品采集后将其置于1 ml无菌0.9%氯化钠溶液中充分悬浮,1 000 rpm离心5 min,弃上清液,沉淀物中加入50 μlDNA提取液悬浮沉淀物。100℃温度下放置10 min,1 000 rpm离心5 min,取2 μl模板上清液加入各自动反应管供nPCR用。
1.4 主要仪器设备
PCR仪,德国Eppendorf公司;DYY-Ⅲ型电泳槽,北京六一仪器厂;Gel Doc 2000凝胶成像系统,美国BIO-RAD公司。
1.5 引物和探针
根据Mg和Uu的16 S rRNA设计特异性引物。外套通用引物为,上游:GAGTTTGATCCTGGCTCAGG,下游:ATTACCGCGGCTGCTGGCAC。内套为,Mg,上游:GCCATATCAGCTAGTTGGT,下游:CTCCAGCCATTGCCTGCTA,产物为242 bp;Uu,上游:GCGGCATGCCTAATACATGC,下游:CTTATTCAAATGGTACAGTCAA,产物为435 bp。
1.6 nPCR反应
第一次扩增:25 μl反应体系中含2.5 μl 10×Tag聚合酶缓冲液,200 μM dNTP, 1 μM引物浓度,1 U Tag DNA聚合酶,10 μl模板DNA。93℃温度下变性2 min,随后93℃温度下放置30 s,55℃温度下放置30 s,72℃温度下放置1 min,扩增35个循环,最后于72℃温度下放置1 min,取10 μl直接点样电泳100 V,10～20 min,于凝胶成像系统下拍照观察,有阳性条带为阳性。每次实验设立阳性和阴性对照。
2 结果
2.1 nPCR检测NGU结果
98例NGU患者Mg和Uu阳性率分别为15.3%和21.4%。
2.2 正常对照组nPCR结果
43例NGU患者Mg和Uu阳性率分别为0和2.3%。
3 讨论
性传播疾病(STD)的发病率近年呈上升趋势,其原因很大程度上归因于缺乏特异、敏感的检测方式而被临床忽视[3]。自20世纪人类首次从患者泌尿生殖道分离出Mg和Uu以来,学者对它的生物学特性和致病性进行了许多研究。Uu和Mg感染往往无特异的临床表现,同时由于其分离培养困难,如Mg往往需要1～2个月才有培养基颜色的改变,因此给临床研究带来了很大困难[4]。若不及时采取有效的治疗,部分感染者可能会出现宫颈炎、盆腔炎,有的甚至引起流产、胎儿畸形等严重后果[5]。因此对于NGU患者应引起高度重视。对于NGU反复感染的患者,不能忽视对Mg和Uu进行检测或治疗。本实验研究结果表明,Mg和Uu的阳性率为15.3%和21.4%,与国内外文献报道结果相符[6]。
PCR 扩增技术问世后2年,有学者发现部分起始模板量较低的PCR实验不易成功。因此有人在第一对引物(外套引物,outer primers)扩增区域内另行设计第二对引物(内套引物,inner primers)并进行扩增。结果发现,这不仅提高了反应的灵敏度,特异性也随之增强。这种应用外套、内套引物分别作二轮PCR扩增的方法称nPCR[7],目前已在组织细胞培养中的支原体污染检测、动物支原体病诊断和人类疾病与支原体感染相关性研究中得到较多的应用。本研究根据Gen bank中报道的支原体基因序列及其他细菌基因序列进行同源性比对分析,选择16 S rRNA支原体种属特异性区域作为扩增区,理论上该引物可检测出近30种支原体[8]。通过对98例患者进行检测,结果显示其具有很好的特征性和重复性,该引物未在其他相关支原体和泌尿生殖道有关病原菌上扩增出相应的片段,因此引物及PCR反应系统具有良好的特异性。由于nPCR原理与PCR相同,只是分别采用外套、内套二对引物分二轮扩增,因此在灵敏度上大大增强,其敏感性可达6～10 U模板DNA。因此nPCR非常适合这种在高难条件下生长的病原体早期的辅助诊断及流行病学调查研究。
[参考文献]
[1]Sung H,Kang SH,Bae YJ,et al ......
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