应用FISH技术检测宫颈脱落细胞中hTERC基因扩增的临床意义(2)
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1.3 FISH判断标准
应用hTERC基因双色探针(hTERC探针购置于北京金菩嘉医疗科技有限公司,为TERC/CSP3DNA探针),HPV阴性、病理诊断为炎症的宫颈脱落上皮中hTERC基因杂交信号为标准确定。取涂片,分别计数100个细胞,记录hTERC基因超过2个杂交信号的异常细胞数(即细胞中出现绿:红<2:2的百分比)。阈值=异常细胞均数+3个标准差,超过此阈值则可诊断为hTERC基因扩增阳性。
1.4统计学方法
结果采用SPSS 13.0统计软件进行分析,采用χ2检验,P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
宫颈脱落细胞标本与TERC/CSP3DNA探针杂交后,均可清晰地看到红色及绿色的探针杂交信号亮点。
2.1细胞学结果
NILM者hTERC基因扩增阳性率为0;ASCUS者为16.67%,LSIL者为71.43%,HSIL者为92.86%,SCC者为100.00%。这表明随着宫颈病变级别增加,hTERC基因扩增阳性率也逐渐增加,hTERC基因扩增在细胞学中存在差异,并随着细胞学病变程度的加重而升高(χ2=11.111,P<0.05),见表1。
2.2组织病理学结果
正常或炎症者hTERC基因扩增阳性率为0,CINⅠ级患者为20.00%,CINⅡ级患者为33.33%,CINⅢ级患者为88.24%,宫颈癌患者为100.00%。这表明hTERC基因扩增在CINⅢ及以上级别病变中明显高于CINⅡ及以下病变,随着组织学病变程度的加重,hTERC基因扩增阳性率也逐渐增加,hTERC基因扩增在不同程度组织学病变中存在差异(χ2=10.824,P<0.05),见表2。
2.3 HPV感染与细胞学分级关系
HPV感染在NILM均为阴性,HPV感染阳性率在ASCUS、LSIL、HSIL+SCC病变中分别为0、42.86%、100.00%,随细胞学病变程度的加重,HPV感染率呈上升趋势(χ2=6.570,P<0.05),见表3。
2.4 HPV感染与hTERC基因扩增关系
HPV感染阳性中hTERC基因扩增显著高于HPV阴性者,二者比较差异有统计学意义(χ2=38.723,P<0.05),见表4。
3讨论
目前宫颈癌筛查主要通过宫颈细胞学检查及HPV检测,但这些方法均不能达到较高的敏感性和特异性。FISH技术是采用直接或间接荧光标记的DNA特异性探针与靶细胞中同源序列的核酸进行杂交,以实现对目的DNA片段或基因的定量和定位分析,可准确鉴别染色体异位和非整倍体[2]。通过FISH检测宫颈细胞学涂片中hTERC基因扩增情况,在宫颈癌和癌前病变诊断中有重要价值,尤其是鉴别出高度病变,提高了筛查的准确性和可预测性。
HPV属于乳头状病毒科A亚群内的一组DNA病毒,为嗜上皮性病毒,该病毒直径50～60 nm,球形,无包膜,20面体立体堆成的核衣壳结构,表面有72个壳微粒,内含8 000个碱基对,分子量5×106 D,基因组是双链环状结构DNA,有3个功能区:早期转录区(E1、E7);晚期转录区(L1、L2);长控制区即非转录区。早期转录区参与病毒DNA复制、转录、翻译调控和细胞转化等功能;晚期转录区可诱导机体产生对HPV的中和抗体,与病毒的增殖有关;非转录区可能对病毒的复制及转录起调节作用。当高危型HPV整合到宿主DNA后,E6、E7可使抑癌基因P53、pRB失活,它们的失活在肿瘤开始发生时起关键作用,凋亡因此受到抑制而发生非程序性增生[3]。Anedcheko E等[4]认为HPV感染尤其是高危性HPV感染使宫颈组织端粒酶激活,是导致最终癌变的重要因素。Andersson S等[5-6]实验表明染色体突变与HPV感染密切相关,认为HPV病毒整合到人类DNA中导致了肿瘤的发生。
端粒酶是一种逆转录酶,可以以自身的RNA为模板合成端粒DNA而避免端粒的缩短。人端粒酶RNA(hTERC)是人端粒酶组分之一,主要由两部分组成:催化亚单位(human telomerase reverse transcriptase, hTERT),RNA模板(huamn telomerase RNA, hTR)和端粒酶相关蛋白。人体大部分体细胞不表达端粒酶,只有在生殖细胞、胚胎细胞中才有表达,而在恶性肿瘤中,端粒酶却能被激活而使细胞获得永生化。hTERC位于3号染色体长臂2区6带(3q26),它编码hTR,在人类的许多肿瘤中都发现有hTERC扩增。在对宫颈病变的研究中,宫颈细胞由非典型性发育异常向宫颈癌转变的过程中几乎都伴有3号染色体长臂的扩增,其中,所涉及最重要的基因可能是人染色体端粒酶基因[7]。研究表明,3q26/8q24扩增的患者进展为宫颈高度病变的风险很大。在宫颈癌及其癌前病变中,端粒酶活性有不同程度的升高,端粒酶激活是高危型HPV感染后导致CIN和宫颈癌的关键步骤,故端粒酶检测成为宫颈癌筛查的一种重要肿瘤标志物。Heselmeyer等[8]首次将FISH三色探针用于宫颈细胞涂片,检测到 hTERC基因扩增,发现在CINⅡ中,该基因扩增者为63%,CINⅢ中为76%,而且可将CINⅡ、Ⅲ级与ASCUS、CINⅠ级区分开来。Nancy P等[9]观察了不同程度宫颈病变中hTERC扩增情况,NILM 0%,ASCUS 13%,LSIL 70%,HSIL 100%,SCCA 100%,hTERC基因的扩增情况随细胞学病变的加重而升高,这与本实验结果基本一致。Heselmeyer等[10]随访这些病例1～3年后,hTERC基因扩增的妇女进展为CINⅢ或浸润癌,故可以把检测细胞涂片中hTERC扩增作为常规手段来判断LSIL向HSIL进展的风险,大大减少细胞学筛查的漏诊率。李静然等[11]发现CIN和宫颈癌组hTERC基因拷贝数明显增加,前者平均拷贝数是2.8,后者是3.2,表明hTERC与宫颈病变程度密切相关,hTERC基因扩增可作为预测高度病变的独立指标 ......
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