回\汉两民族2型糖尿病视网膜病醛糖还原酶基因启动子区C(-106)T多态性的比较(2)
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参见附件(3163KB，3页)。
正常对照组(CON)：共 83例，男42例， 女41例，年龄40～70岁，以上均为健康体检者，无糖尿病及其他自身免疫性疾病。
1.2 实验方法
1.2.1 引物设计与合成根据Genebank提供的ALR的基因序列应用Primer Premier引物设计软件自行设计了引物(由宝生物工程有限公司合成)，序列为上游引物为：5′GAATCTTAACATGCTTAG 3′，下游引物为：5′GCCCAGCCCTATACCTAC 3′，特异性扩增ALR基因包含启动子区C(-106)T多态的一段376 bp的DNA序列。
1.2.2 人类基因组DNA提取采用柱式DNA提取试剂盒 (购自上海生工生物工程有限公司) ，按照说明书的步骤进行提取，提取后的基因组DNA，-20℃保存备用。
1.2.3 PCR扩增反应体系为25 μl，其中包括10×PCR buffer 2.5 μl， dNTP mixture 2.5 μl， TaqDNA聚合酶2 μl(0.5 U/μl)，特异性引物各1.5 μl(2 pmol/μl)，模板DNA 2 μl， MgCl2 1.5 μl(10 mmol/μl)，不足体积用灭菌双蒸水补足至25 μl。置PCR 2400热循环仪(美国应用生物公司生产)，94℃预变性5 min，再按下列程序循环34次，即94℃变性45 s，59℃退火45 s，72℃延伸45 s；末次循环后，72℃延伸10 min。
1.2.4 扩增产物的限制性酶切取PCR扩增产物10 μl，用限制性内切酶XspⅠ10 U(购自大连宝生物工程有限公司)酶切，37℃孵育4 h，反应终止后，消化片段在2%琼脂糖凝胶上电泳，溴化乙锭(EB)染色，染色后通过法国VL凝胶成像系统判断结果。
1.2.5 血糖、血胰岛素、糖化血红蛋白水平测定氧化酶法测定血糖、放免法测定血胰岛素、比色法测定糖化血红蛋白。HOMA胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)=FPG×FINS/22.5。
1.3 统计学处理
应用拟合优度χ2检验ALR基因型频率是否符合Hardy-Weinberg(H-W)遗传平衡定律。非正态分布变量，用自然对数转换成正态分布，取其自然对数进行统计，在数值表达式中还原成原值。计量资料用均数±标准差(x±s)表示，组间比较采用ANOVA检验，基因型频率以及等位基因频率的比较采用χ2检验。P<0.05为差异具有统计学意义。以上数据均在SPSS 11.5软件包上完成。
2 结果
2.1 基因型分析
含ALR基因C(-106)T多态的376 bp扩增产物自身有一XspⅠ内切酶的特异性识别位点，酶切后产生89 bp、287 bp 2条片段，C→T 变异后可产生一新的酶切位点，将287 bp 片段切为228 bp和59 bp 2个片段。经XspⅠ限制性内切酶消化后，可产生以下三种基因型：CC型(287 bp，59 bp 2条带)， CT型(287 bp，228 bp，89 bp，59 bp 4条带)，TT型(228 bp，89 bp，59 bp 3条带)。见图1。
2.2 各组临床资料比较
各组间年龄、BMI差异无统计学意义(P>0.05)， HOMA-IR、HbA1c显著增高(P<0.05)，NDR组HDL-C低于CON组(P<0.05)，DR组LDL-C显著高于CON组(P<0.05)。其余指标各组间均差异无统计学意义(表1)。
2.3 ALR基因C(-106)T多态基因型检测
因TT型例数较少，故分析时将TT与CT型合并，ALR基因C(-106)T多态各基因型及等位基因分布频率在对照组和2型糖尿病组间差异无统计学意义(χ2=3.601，P=0.058；χ2=3.428，P=0.064)；糖尿病视网膜病组CT/TT基因型及T等位基因频率较无糖尿病视网膜病组均高，但差异无统计学意义；糖尿病视网膜病组T等位基因及CT/TT基因型分布频率明显高于正常对照组，差异有统计学意义(χ2=4.914，P=0.027；χ2=4.006，P=0.045)。相对危险度分析发现，CT+TT基因型患糖尿病视网膜病的风险是CC基因型的2.127倍(OR=2.127，95%CI：1.010～4.478)；携带T等位基因患糖尿病视网膜病的风险是C等位基因的1.962倍(OR=1.962，95%CI：1.075～3.581)(表2)。
2.4 ALR基因C(-106)T多态在回、汉两民族2型糖尿病组间的比较
在甘肃地区67例回族2型糖尿病患者进行ALR基因C(-106)T多态性的研究中，发现其中36例为CC型，22例为CT型，9例为TT型[1]，对67例回族2型糖尿病患者及83例汉族2型糖尿病患者C(-106)T基因型及等位基因分布频率进行比较：回族CT/TT基因型及T等位基因均高于汉族，但是差异无统计学意义(χ2=0.049，P=0.824；χ2=0.398，P=0.528)(表3)。
3 讨论
人类ALR基因定位于染色体7q35，全长约18 kb。1999年Kao YL等[2]在ALR基因启动子区发现了一个新的C(-106)T单碱基突变，携带C等位基因的1型糖尿病患者发生视网膜病变的危险性增加。已有实验表明：ALR基因C-106T多态性波兰人[3]、高加索人[4]中2型糖尿病的微血管病变有相关性。有研究表明，携带T等位基因是糖尿病视网膜病的保护性因素，而C等位基因则是糖尿病视网膜病的易感基因[5]。Li Q等[6]发现携带C等位基因能增加ALR mRNA的表达；而有的研究则表明[7]T等位基因与中国人糖尿病微血管并发症密切相关。笔者对甘肃地区67例回族2型糖尿病患者进行ALR基因C(-106)T多态性的研究，发现存在该位点多态性，且T等位基因与糖尿病视网膜病的发生有关[1]。
本研究采用PCR-RFLP的方法，对甘肃地区汉族人群进行ALR基因5'调控区-336～+40的DNA片段进行分析，发现存在C、T两种等位基因和CC、CT、TT三种基因型。正常对照与2型糖尿病患者间比较，基因型CC、CT、TT及等位基因C、T的频率均无统计学意义 ......
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