血管紧张素受体拮抗剂在进展性肾炎大鼠模型中对慢性低氧引起肾小管间质损害的抑制作用(2)
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1.4 观察指标与方法
1.4.1 24 h尿蛋白定量分别于第4、8周收集24 h尿液，用双缩脲法测定尿蛋白含量。
1.4.2 血生化检测 取大鼠心脏血，测定血肌酐(Scr)。
1.4.3 肾组织病理学检查5%中性甲醛固定肾组织，石蜡包埋，常规HE、PAS、MASSON染色，显微镜下观察肾脏病理改变。
1.4.4 原位杂交法检测取3 μm厚石蜡切片，常规脱蜡至水，灭活内原性酶，热修复抗原，抗原抗体反应，DAB显色、脱水、透明、封片、显微镜观察。HIF-1α mRNA原位杂交所用探针为经地高辛标记的针对HIF-1α基因的多相寡核苷酸探针，操作步骤按HIF-1α原位杂交试剂盒(Boster)说明书进行。阳性产物呈深紫色，不加探针为阴性对照。
1.4.5 肾脏病理、原位杂交分析①肾间质面积测量：在400倍光镜下用PAS染色标本，每个标本选取10个肾小管间质视野(避开肾小球和大血管)，每个视野分别测量肾间质面积与统计场面积的比值。②原位杂交分析：采用显微图象分析系统(Olympus C3040-ADU)对各组染色结果进行积分光密度值(integral optical density，IOD)测定，每张切片随机选取10个高倍视野，每个视野代表0.13 mm2的区域面积，计算其IOD，取平均值。
1.5 统计学处理
数据用平均值±标准差(x±s)表示。用SPSS 11.5统计软件分析，组间差异比较采用t检验，相关性检验采用Pearson分析。
2 结果
2.1 收缩压
第4周时模型组和假手术组间无明显改变，第8周大剂量氯沙坦组较8周未给药组(P<0.01)和第4周手术组(P<0.05)收缩压有明显下降，小剂量氯沙坦组收缩压的下降较8周未给药组和第4周手术组差异无统计学意义(表1)。
2.2 生化指标检测
①血肌酐：第4周模型组较假手术组明显升高(P<0.01)，第8周未给药组较假手术组显著升高(P<0.001)，大剂量氯沙坦组较8周未给药和第4周模型组显著下降(P<0.01)，小剂量氯沙坦组较8周未给药(P<0.01)和第4周模型组(P<0.05)亦有下降(表1)。②24 h尿蛋白：第8周未给药组(P<0.001)和第4周模型组(P<0.01)较假手术组显著升高，大剂量氯沙坦组明显低于第8周未给药组(P<0.001)、第4周模型组(P<0.01)和小剂量氯沙坦组(P<0.05)(表1)。
2.3 肾组织形态学
PAS染色显示(图1)：假手术组肾小管间质形态基本正常，肾间质相对面积为0.075±0.006；第4周手术组可见肾小管上皮细胞萎缩、部分肾小管扩张、间质水肿，炎症细胞浸润并出现纤维化，肾间质相对面积扩大为0.180±0.030，与假手术组比较差异有统计学意义(P<0.01)；第8周未给药组大部分肾小管上皮细胞脱落，管腔扩张，管型堵塞，间质炎症和纤维化进行性加重，肾间质面积进一步扩大为0.260±0.050，与假手术组比较差异有统计学意义(P<0.01)。小剂量氯沙坦组肾小管间质的损伤得到改善，肾间质面积减小至0.130±0.020，与8周未给药组比较差异有统计学意义(P<0.01)；大剂量氯沙坦组肾小管间质的损伤得到显著的修复，肾间质面积进一步缩小至0.099±0.007，不仅与8周未给药组(P<0.01)，且与第4周手术组(P<0.01)和小剂量氯沙坦组(P<0.05)比较差异有统计学意义(表1)。
2.4 HIF-1α mRNA的原位杂交检测
假手术组表达微弱，在第4周模型组和第8周未给药组HIF-1α mRNA表达明显增加，主要集中在肾小管上皮细胞的胞浆，与假手术组比较差异有统计学意义(P<0.001)；小剂量氯沙坦组HIF-1α mRNA的表达较8周未给药组降低(P<0.01)；大剂量氯沙坦组HIF-1α mRNA表达明显下调，不仅与8周未给药组(P<0.001)，且与第4周模型组和小剂量氯沙坦组(P<0.01)比较差异有统计学意义(表1)。
3 讨论
近来有研究提出[1,3]肾小管-间质细胞的慢性低氧可能在肾纤维化的发生、发展中起重要作用。如低氧可使人肾脏成纤维细胞TGF-β mRNA表达增加，在CTGF mRNA转录增加这一过程中也需要低氧诱导因子-1(Hypoxia inducible factor-1，HIF-1)的存在，而且HIF-1介导缺氧刺激CTGF表达独立于TGF-β途径[4]。HIF-1α在体内特异地受氧浓度调节，可作为低氧的指标[5]。因此笔者在进展性肾炎(progressive nephritis)大鼠模型[6]中，以氧浓度敏感的HIF-1α为低氧标志物，观察在慢性低氧状态下，肾小管间质细胞HIF-1α mRNA的表达，以及予不同剂量血管紧张素受体拮抗剂氯沙坦干预后HIF-1α mRNA表达的变化，探讨氯沙坦在慢性低氧状态下是否对肾小管间质的损害有抑制作用。
进展性肾炎大鼠[5]是目前观察慢性肾脏病进展比较理想的动物模型，该模型于4周后肾小管间质的有效循环血流量下降近40%，出现持续的肾小管间质缺血缺氧，肾功能处于氮质血症期直至11周，可持续使用血管紧张素受体拮抗剂，并有利于观察低氧状态对肾脏的损害。本研究表明在第4周模型组，血肌酐(P<0.01)、24 h尿蛋白(P<0.01)较假手术组明显升高，说明动物模型是成功的，与他人的研究结果一致[6-7]。且从第4周到第8周手术组血肌酐(P<0.05)、24 h尿蛋白(P<0.01)值持续上升，显示慢性低氧可引起进展性肾炎大鼠肾功能持续的损害和24 h尿蛋白进行性增加。有报道已证实[8]，在进展性肾炎大鼠模型中, 发生小管纤维化前, 肾小管存在明显的缺氧。本研究模型组均存在肾小管扩张、间质水肿及纤维化，肾间质相对面积在第4周时扩大为0.180±0.030；第8周未给药组显示大部分肾小管上皮细胞脱落，管腔扩张，管型堵塞，间质炎症和纤维化进行性加重，肾间质面积进一步扩大为0.260±0.050，与假手术组比较差异有统计学意义(P<0.01)。HIF-1α mRNA从第4周手术后(P<0.001)至8周未给药(P<0.001)间呈持续的高表达，较假手术组均明显升高；且肾小管间质的损害呈正相关(r=0.842，P<0.01)。
血管紧张素受体拮抗剂氯沙坦可竞争性抑制AngⅡ与其受体结合 ......
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