转化生长因子β对成骨细胞增殖\BMP-2及Cbfal基因表达的影响(2)
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1.3 统计学处理
应用SPSS 13.0统计学软件对实验数据进行分析，数据以x±s表示。方差齐，组间比较用LSD-t检验；方差不齐，组间比较用Dunnett T3法检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1成骨细胞的鉴定
在生化和组织化学上，成骨细胞的鉴定主要根据成骨细胞的特异性分泌蛋白，如碱性磷酸酶、骨钙素和体外矿化的功能特征[2]。成骨细胞碱性磷酸酶染色多数的细胞核和细胞质灰黑至深黑色颗粒状或片状沉淀显示强阳性，符合成骨细胞特征(图1)，第5代细胞形成明显的矿化结节，茜素红染色呈橘红色(图2)。
2.2 成骨细胞增殖能力
结果表明，随着TGF-β浓度的增加，各组OD值增高，且呈浓度依赖性，实验组(2组，0.01 ng/ml；3组，100 ng/ml)与对照组(1组，0 ng/ml)，组间比较，差异有统计学意义(P<0.05)(表1)。
2.3 TGF-β对成骨细胞BMP-2、Cbfal基因表达的影响
结果表明，随着TGF-β浓度的增加，成骨细胞BMP-2、Cbfal基因表达增加，光密度比值增加，且呈剂量依赖性。实验组BMP-2、Cbfal与对照组Gapdh，实验组组间比较，差异均有统计学意义(P<0.01)(图3，表2)。
3 讨论
骨质疏松已被WHO视为继心血管疾病后，第二大致残的健康问题。随着社会的老龄化和生活水平的提高其患病率逐年增加。目前在世界常见病、多发病中居第7位，仅我国患者已超过9 000万，即每14人中就有1人患不同程度的骨质疏松[3]。成骨细胞来源于骨髓间充质干细胞，是骨形成过程中的重要功能细胞，其主要功能是分泌骨基质。TGF-β不仅调节骨和软骨细胞的生长，还能够介导多种细胞因子对骨的调节，在骨代谢调节过程中发挥重要作用。本研究采用不同浓度的TGF-β刺激成骨细胞，结果表明随着TGF-β浓度的增加，成骨细胞增殖明显增加，100 ng/ml促增殖作用最强，即TGF-β对成骨细胞的促增殖作用具有浓度依赖性，还有学者分析发现TGF-β以时间和剂量依赖的方式，直接激活成骨细胞分泌的骨保护素(OPG)启动子的活性，促进OPG表达[4]，TGF-β对成骨细胞增殖作用机制有待进一步研究。20世纪60年代末Urist提出了骨诱导理论[5]，证实生长因子是骨组织发生的决定因子，BMP是一种二聚物分子，来源于骨及骨源性细胞，是骨代谢的旁分泌产物，是唯一能够诱导异位成骨的因子，无论原位还是异位，BMP都将发挥决定性作用，没有BMP的存在就不能成骨[6]。杜俊杰等[7]通过实验证明TGF-β可增强BMP-2诱导成骨中Ⅰ、Ⅱ型胶原mRNA及碱性磷酸酶的表达，认为BMP-2有明显的诱导成骨性，而且TGF-β明显增强BMP-2在体内的诱导成骨作用，由此推测TGF-β促进成骨细胞的增殖、分化可能是通过增强BMP-2基因的表达所致。核心结合因子(Cbfal)作为第一个被识别的成骨细胞特异性转录因子，表达于成骨细胞系早期，与骨钙素启动子特异性DNA序列结合，现已证明Cbfal是成骨细胞特异性表达的两个关键调控者之一，是最重要的一个成骨特异性基因。Cbfal在成骨细胞系分化和成熟过程中起重要作用，对成骨细胞的分化和骨形成十分必要[8]。Harada H等[9]对3种亚型Cbfal功能进行研究，发现稳定转染Cbfal均可诱导或上调骨钙素、骨桥素和Ⅰ型胶原mRNA的表达，与成骨细胞分化相关。Sailer HF等[10]证实BMP-2能诱发骨形成，体外实验还发现BMP可以直接作用于成熟的破骨细胞来诱导其骨吸收活性。动物实验表明BMPs成骨效应最广泛和彻底[11]。Cbfal在成骨细胞系中高表达。它除了能够结合骨钙素基因2于启动子区的成骨细胞顺时原件2并激活该基因的转录外,还能调节成骨细胞中多个基因[12-13]。成骨是一个复杂的多因素参与过程，除了BMP等生长因子或激素外，细胞外基质也发挥一定作用，最近有研究证实TGF-β信号的Smad 2蛋白分子在成骨细胞的表达中对Cbfal基因的表达有调控作用。本研究表明TGF-β能促进体外大鼠成骨细胞Cbfal基因的表达，且呈浓度依赖性。综上所述，TGF-β可以通过调节多种细胞因子促进成骨细胞的增殖分化，其在骨代谢的调节网络中占有重要地位。
[参考文献]
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[7]杜俊杰,罗卓荆,胡蕴玉,等.TGF-β增强人重组rh BMP-2诱导成骨中Ⅰ、Ⅱ型胶原mRNA及碱性磷酸酶的表达[J].中国矫形外科杂志,2003,11(24):1696-1698.
[8]Hoshi K,Komori T,Ozowa H.Morphological characteriza-tion of skeletal cells in Cbfal-deficient mice[J] ......
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