川芎嗪对人肝星状细胞TGF-β1信号传导的影响(2)
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参见附件(3068KB，3页)。
1.2 细胞
人肝星状细胞株Lx-2，购自上海坤肯生物化工有限公司。
1.3 试剂
Trizol，北京赛百盛基因技术有限公司。Oligo，上海捷瑞生物工程有限公司。RT-PCR试剂盒，宝生物工程(大连)有限公司。
1.4 方法
1.4.1 细胞培养Lx-2细胞株为表型活化的HSC。采用含10% 小牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素的DMEM培养液，常规培养于37℃、5% CO2培养箱中，每3~4天传代1次。
1.4.2 实验分组实验分为TMP组、阳性对照组、阴性对照组。其中TMP组包括A组50 mg/L、B组200 mg/L、C组800 mg/L 3个剂量组；阳性对照组选择苦参素作为阳性对照药物，用药剂量为500 mg/L；阴性对照组，加入等容量不含药物的培养液。
1.4.3 RT-PCR法检测TGF-β1及其Ⅰ型和Ⅱ型受体、Smad 3及Smad 7mRNA表达制备细胞爬片，分别加入各组药物后继续培养48 h。引物设计，根据Genebank中人TGF-β1及其Ⅰ型和Ⅱ型受体、Smad 3及Smad 7mRNA或cDNA基因序列，采用Primer Premier 5软件设计RT-PCR测定所需引物序列：GAPDH(212bp)A：5′-CCTGGAAGATGGTGATGGGATT-3′，S：5′-GAACGGATTTGGTCGTATTGGG- 3′；TGF-β1(321bp)A：5′-CTAAGGCGAAAGCCCTCAAT- 3′，S：5′-GCAGGAAACCCACAACGAA- 3′；TβRⅠ(287bp)A：5′-CCTCACGGAACCACGAAC- 3′，S：5′-CCGCACTGTCATTCACCA- 3′；TβRⅡ(387bp)A：5′-TGTCCCAGAGCACCAGAG- 3′，S：5′-ACGCCAAGGGCA ACTTAC- 3′； Smad 3(354bp)A：5′-GGCTGGCCGAATAGTGA-3′，S：5′-GGACAGTGGCTGGAAGAGT- 3′；Smad 7(358bp)A：5′-ATCGG GTATCTGGAGTAAGG- 3′，S：5′-ACTCGGTGCTCAAGAAACTG- 3′。Trizol抽提总RNA，方法按照试剂说明书操作，用紫外分光光度计测定RNA浓度，RNA浓度为1.8。逆转录扩增按试剂盒说明书操作，PCR循环参数为94℃ 2 min预变性，94℃ 30 s、58℃ 30 s、72℃ 1 min循环30次，72℃延伸7 min，4℃保存。取10 μl RT-PCR产物，1.5%含0.5×TBE的琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察，用Quantity One软件进行光密度分析。
1.5 统计学处理
统计结果用SPSS 10.0软件包处理，所有数据以均数±标准差表示，组间差异用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD法检验，统计前均对各组数据进行正态性检验和方差齐性检验，取α＝0.05为显著性检验水准。
2 结果
2.1 TMP对HSC中TGF-β1 mRNA表达的影响
与阴性对照组相比，TMP组、阳性对照组TGF-β1 mRNA相对表达量均差异有统计学意义(P<0.01)；与阳性对照组相比，TMP 50 mg/L 、200 mg/L 浓度组差异无统计学意义(P>0.05)，TMP 800 mg/L 浓度组TGF-β1 mRNA相对表达量显著降低，差异有统计学意义(P<0.01)(表1)。
2.2 TMP对HSC中TβRⅠmRNA表达的影响
与阴性对照组相比， TMP 200 mg/L、800 mg/L组TβRⅠmRNA相对表达量降低，其差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)；与阳性对照组相比，TMP 800 mg/L组TβRⅠmRNA表达量差异有统计学意义(P<0.01)(表1)。
2.3 TMP对HSC中TβRⅡmRNA表达的影响
与阴性对照组相比，阳性对照组TβRⅡmRNA表达量显著降低(P<0.01)，TMP 200 mg/L、TMP 800 mg/L浓度组的TβRⅡmRNA相对表达量均差异有统计学意义(P<0.01)；与阳性对照组相比，TMP 200 mg/L 浓度组差异无统计学意义(P>0.05)，TMP 200 mg/L 、800 mg/L 浓度组TβRⅡmRNA表达量差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)(表1)。
2.4 TMP对HSC中Smad 3 mRNA表达的影响
与阴性对照组相比，阳性对照组Smad 3 mRNA表达量显著降低(P<0.05)，TMP 200 mg/L、 800 mg/L浓度组的Smad 3 mRNA相对表达量均差异有统计学意义(P<0.01)；与阳性对照组相比，TMP 800 mg/L浓度组Smad 3 mRNA表达量差异有统计学意义(P<0.01)(表1)。
2.5 TMP对HSC中Smad 7 mRNA表达的影响
与阴性对照组相比，TMP 200 mg/L、800 mg/L组Smad 7 mRNA表达量显著升高，其差异有统计学意义(P<0.01)；与阳性对照组相比，TMP 800 mg/L组Smad 7 mRNA表达量的差异具有统计学意义(P<0.01)(表1)。
3 讨论
目前所公认的肝纤维化形成过程大致为，致肝损伤因子如病毒性肝炎、化学毒物质等造成肝细胞损伤坏死；激活枯否细胞(Kupffer Cells, KC)，释放大量细胞因子和活性氧；继之肝星状细胞(Hepatic Stellate Cells, HSC)被激活、转化为肌成纤维细胞(Myofibroblaster, MFB) ......
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