白花蛇舌草总黄酮的超声提取工艺研究(2)
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2.3.2 测定波长的选择取一定量供试品溶液和芦丁对照品溶液，按“2.3.1”项下的方法进行显色，以50%乙醇做空白试剂，平行操作，在400～600 nm波长范围内进行紫外扫描。图谱如图1所示，二者的最大吸收波长均在505 nm处。因此，选择505 nm作为测定波长。
2.3.3 标准曲线的绘制分别精密吸取对照品储备液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 、6.0 ml，置于10 ml具塞刻度试管中，按“2.3.1”项下方法显色，用对照品储备液为0.0 ml的试管做空白对照，于505 nm处测定吸光度。以芦丁对照品溶液浓度c(mg/ml)为横坐标，吸光度A为纵坐标作图，得回归方程：y=11.728x-0.008 5(r=0.999 4)。结果表明，芦丁在0.010 16～0.061 00 mg/ml浓度范围内与吸光度呈现良好线性关系。
2.3.4 精密度试验取2 ml同一浓度芦丁对照品溶液(0.101 6 mg/ml)，按“2.4“项下方法操作，测定吸光度，连续测定5次。测得吸光度值的RSD为0.37%(n=5)，结果表明，仪器精密度良好。
2.3.5 稳定性试验取同一份供试品溶液，按“2.4”项下方法操作，分别在0、15、20、25、30、35 min和40 min测定吸光度A，结果吸光度值的RSD为1.79%，表明供试品溶液在40 min内稳定性良好。
2.3.6 加样回收率试验取5份已知总黄酮含量的白花蛇舌草粉末约0.5 g，精密称定，分别精密加入芦丁对照品11.76 mg(即将芦丁对照品配制成0.588 0 mg/ml的溶液，每个试验号精密加入对照品溶液20 ml，挥去溶剂后再加入样品进行提取)，按供试品的制备方法操作，计算加样回收率。结果平均回收率为96.69%，RSD为1.34%，n=5。结果见表1。
2.4 样品的含量测定
精密移取1 ml供试品溶液至10 ml具塞刻度试管中，按“2.3.1”项下方法显色并进行紫外测定，将吸光度代入回归方程计算总黄酮的含量，并计算出提取率。
总黄酮提取率(%)=(y+0.0085)×10×100/(11.728×1 000×w)×100。
式中：y为吸光度，w为白花蛇舌草粉末的取样量。
2.5 乙醇浓度的考察
1.0 g白花蛇舌草粉末经过石油醚脱脂2次，选择料液比为1:20，提取时间为20 min，提取次数为2次的条件下，以乙醇浓度分别为50%、60%、70%、80%、90%进行超声提取，结果见图2。在体积分数为70%时，提取率达到峰值，故选择溶剂体积分数在60%～80%较为合适。
2.6 正交试验
以乙醇浓度(A)，料液比(B)，超声时间(C)，提取次数(D)为4个因素，每个因素选用3个水平，用L9(34)正交表进行试验，每个试验重复进行2次。因素水平见表2，正交试验结果见表3、4。
表4方差分析结果表明，各因素对试验结果均有显著性影响，影响大小顺序为D>A>C>B。由表3中极差R可知，最佳组合为A2B2C2D3，即乙醇浓度为70%，料液比为1:20，提取时间为30 min，提取次数为3次时总黄酮的提取率最高。
2.7 最佳提取工艺条件的验证
取供试品5份，每份约1.0 g，精密称定。用石油醚脱脂2次后，按最优条件A2B2C2D3平行操作，按“2.4”项下方法测定吸光度，根据标准曲线方程进行计算，测得总黄酮的平均含量为2.375 6%，RSD为1.29%。结果见表5。
3 讨论与结论
若采用将提取液直接浓缩蒸干，然后加水溶解上柱，发现会有部分脂溶性黄酮析出，使检测结果明显偏低。故将0.4 g聚酰胺粉末加入提取液中搅拌蒸干，使总黄酮充分吸附在聚酰胺粉末上，然后再采用干法上柱进行净化洗脱操作[9]。白花蛇舌草含有较多的叶绿素，直接提取会干扰紫外分光光度法的测定结果。提取前先用石油醚超声2次，可以去除大部分的叶绿素，而且可以提高总黄酮的提取率[10]。稳定性试验中，每隔5 min测定了样品的吸收度，结果40 min时其吸收度降为0.447 0，并且溶液颜色已开始变浅，RSD为1.79%。考虑到对测定结果准确性的影响，故应在显色后40 min内测定。而15 min时其吸收度最大，故选择在显色15 min后进行测定。由于时间限制，正交试验里的因素水平表，除了因素A(乙醇浓度)是通过单因素考察确定水平参数范围外，B(料液比)、C(提取时间)、D(提取次数)均是通过参考相关文献制定的。在今后的工作中，可分别对各因素进行单因素考察，进一步优化实验结果。
本实验通过正交试验研究了乙醇浓度、料液比、提取时间和提取次数对提取白花蛇舌草总黄酮效果的影响。结果表明，最佳提取条件是：石油醚脱脂2次后，采用70%乙醇，料液比为1:20，超声时间30 min，提取3次，其中提取次数对提取过程影响最大。该最佳工艺条件下，白花蛇舌草总黄酮的提取率为2.375 6%。超声提取法操作简单、快捷，能实现常温提取，可应用于白花蛇舌草总黄酮的提取。随着临床研究的进一步发展，白花蛇舌草总黄酮的药理作用及作用机制，将进一步被阐释。因而对白花蛇舌草总黄酮进行深度开发，研制新的制剂，寻找新的适应证，将会进一步满足临床需求，产生更大的社会与经济效
[参考文献]
[1]江苏新医学院.中药大辞典[M].上海:上海科技出版社,1977:754.
[2]方岩雄,张永成,陈敏敏,等.抗肿瘤药物白花蛇舌草及其活性成分[J].中成药,2004,26(7):577-578.
[3]王宇翎,张艳,方明,等.白花蛇舌草总黄酮的抗炎及抗菌作用[J].中国药理学通报,2005,21(3):348-350.
[4]王宇翎,张艳,方明,等.白花蛇舌草总黄酮的免疫调节作用[J] ......
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