一氧化氮对大鼠心脏骤停复苏后脑组织作用研究(2)
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参见附件。
1 资料与方法
1.1 实验动物及分组
6～8周龄健康雄性SD大鼠(南昌大学医学院动物科学部提供)90只，体重230～280 g。按随机数字表法随机分成假手术(A)组、NS对照(B)组、iNOS抑制剂干预(C)组，每组分为6个时间点，每时间点6只，分别为6、12、24、48、72 h时间点；于各点断头取脑组织行NO及脑组织含水量检测。A组仅给予股动静脉置管及气管插管，B、C组行股动静脉置管及气管插管后制作窒息致SCA模型；B组注入C组同等剂量的0.9%氯化钠溶液予以对照；C组在复苏后即刻给予以iNOS抑制剂0.2 mg/kg剂量静脉快速注入。
1.2 动物模型的制作
采用气管夹闭窒息法来建立SCA模型。常规气管切开插管及动静脉置管，在动物HR、BP及R稳定后，夹闭气管插管导管端8 min，致动物窒息而使其出现心跳、呼吸停止，心电监护示收缩压 ≤ 25 mm Hg，心率呈直线，或心电图示心室纤颤、停止或电机械分离；后开放气道，频率为200次/min，呼吸机辅助通气(100%纯氧)，通气频率90次/min，潮气量6 mL/kg，同时进行人工胸外按压，按压深度为大鼠胸廓前后径的1/3，助手快速静脉推注肾上腺素20 μg/kg(必要时追加同等剂量)。所有实验参数设计和记录均参照实验研究的Utstein模式[2]。
1.3 脑组织NO含量测定
各时间点取脑组织，使用NS制备成10%脑组织匀浆，室温静置10 min后于2 000 r/min离心10 min，再取上清液0.5 mL。采用硝酸还原酶法脑匀浆NO测定。
1.4 脑组织含水量测定
各时间点取脑组织后风干，天平称重，然后放入80℃恒温电烤箱中烤24 h，烤至恒重后，再称重计算脑组织含水量，计算公式：脑组织含水量＝(脑湿重-脑干重)/ 脑湿重×100%。
1.5 统计学方法
所有数据用SPSS 13.0软件进行分析，计量资料结果以(x±s)表示，若方差不齐，采用秩转换的非参数Kruskal-Wallis H检验。计量资料若方差齐同，多样本间均数多重比较用SNK-q检验；均以P < 0.01为差异有高度统计学意义，P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 脑组织NO的表达
与A组比各组脑组织NO浓度明显升高，差异有高度统计学意义(P < 0.01)；而B、C组相应时间点相比差异均有统计学意义(P < 0.01或P < 0.05)。见表1。
2.2 脑组织含水量
与A组比B、C组脑组织含水量明显增多，差异有高度统计学意义(P < 0.01)。与B组比，C组脑组织含水量差异具有统计学意义(P < 0.05或P < 0.01)。见表2。
3 讨论
1987年，研究[3]确认NO即为内源性内皮舒张因子，是一种结构简单的小分子气体，具有脂溶性和水溶性，水中溶解度为1 mmol/L，极易透过细胞膜，可在细胞内、外自由扩散，因其带有不成对电子而具自由基结构，是一种重要的神经递质；其易被氧化，很不稳定，半衰期仅为5～30 s。动物实验表明NO对缺血性脑损伤具有一定的保护作用，可调节脑血管张力[4]、抑制白细胞及血小板聚集黏附[5]、阻断NMDA受体、抑制NMDA受体介导的神经毒素作用[6]、减少内皮素的生成[7]、减少神经元凋亡[8]等；但过量的NO又具有伤害作用，这取决于NO产生的部位、时间、浓度和催化NO合成的酶系。目前已证实有3种NOS同工酶，即nNOS、eNOS和iNOS[9]。张劲松等[10]动物实验证实，缺血再灌注后，大鼠脑损伤侧脑室中eNOS活性下降，而NO和iNOS含量上升，提示脑缺血后脑组织iNOS可介导产生过量的NO；Wang P等[11]研究表明，脑损伤后iNOS被激活，能在短时间内生成高于正常时上千倍的NO。nNOS、eNOS二者合称为cNOS，在生理条件下即有表达，活性是短暂的，产生适量NO而调节正常生理功能[12]。NO在缺血缺氧中起着极其重要的损伤作用，其主要损伤作用机制可能为：(1)加重脑水肿。脑损伤后NO含量剧增，导致脑血管内皮细胞受损，血脑屏障受到破坏，组织间隙液体增加；同时可导致脑血管的调节功能障碍，减缓水肿液的消退；颅脑损伤时，NO亦可损害线粒体，使ATP产生不足，碍致使Na+-K+-ATP酶活性降低，通过Na+、K+交换，K+逸出细胞外，Na+在细胞内积聚，从而产生细胞内水肿[13]；(2)自由基作用[14]。NO具有不同的还原状态，即NO+、NO-、NO，过量的NO与体内超氧阴离子形成过氧亚硝基阴离子(ONOO-)，其中以ONOO-的损伤作用最为严重，其本身亦是一种自由基，可引起广泛的脂质过氧化和蛋白酪氨基反应；(3)抑制细胞呼吸[15]；(4)破坏DNA[16]；(5)介导兴奋性氨基酸(EAA)对神经元的毒性作用，徐超等[17]认为NOS抑制剂对脑损伤的主要作用是促进抑制性氨基酸的释放。
本研究发现，窒息致大鼠SCA复苏成功6 h后脑组织NO含量上升，24 h达高峰，与脑水肿程度一致，给予诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)抑制剂能抑制大鼠脑组织NO表达，减轻脑水肿，说明病理条件下产生的NO对脑组织起损伤作用。
[参考文献]
[1] Cooper S，Cade J. Predicting survival，inhospital cardiac arrest：Resuseitation survival variables and training effectiveness[J]. Resuseitation，1997，35(1)：2-17. ......
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