去垢剂对单向免疫扩散法测定流感病毒疫苗血凝素含量的影响(2)
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参见附件。
1.3.2 裂解时间的比较 取A/Victoria/210/09 (H3N2)(NYMCX-187)标准抗原和亚单位疫苗原液2，分别加入1/9体积的10%(w/v)去垢剂，在室温条件下分别放置不同时间进行裂解。其中，各裂解时间组的标准抗原均稀释为1、0.75、0.50、0.25倍浓度，完整病毒液2和亚单位疫苗原液2分别稀释12倍和15倍后进行裂解。所有抗原样本经处理后同时加至抗体凝胶板中进行SRID。
1.4 SRID实验
用PBS配制1%琼脂糖溶液，加热融化后降温至45℃，按说明书中的建议量加入标准抗血清，混匀后倾注在扩散板上(凝胶厚度为2 mm)，待琼脂糖溶液凝固后用4 mm直径的打孔器打孔并除去孔内凝胶，即为抗体凝胶板。
向抗体凝胶板的各加样孔中分别加入18 μL处理后的抗原样本，将凝胶板置于湿盒内室温扩散至少18 h。凝胶经漂洗、压薄、干燥后进行染色、脱色，测量沉淀圈直径[8]。
2 结果
2.1 去垢剂浓度的比较
将标准抗原、完整病毒液1、亚单位疫苗原液1三个抗原样本分别以终浓度为0、0.037 5%、0.062 5%、0.125 0%、0.250 0%、0.500 0%、1.000 0%、2.000 0%的去垢剂于室温下同时裂解30 min后进行SRID，测量沉淀圈直径，然后根据三组样本的沉淀圈直径绘图，见图1。
从3条曲线的形态可以看出，去垢剂终浓度由0增加至0.125%时，3种抗原的沉淀圈均逐渐增大；当去垢剂浓度由0.125%增至2.00%时，标准抗原和亚单位疫苗的沉淀圈直径无明显变化，而完整病毒的沉淀圈仍随去垢剂浓度的增大而变大，直到去垢剂终浓度达到1%时，才不再增大。这说明不论是标准抗原、亚单位疫苗还是完整病毒，在进行SRID实验前都需要进行裂解；标准抗原和亚单位疫苗因为事先都经过了一定的裂解过程，故需要的去垢剂浓度较低(0.125%)，而完整病毒则需要使用较高浓度(1%)的去垢剂才能够充分裂解。
图1中亚单位疫苗与标准抗原两条曲线几乎是平行的，这说明去垢剂浓度的变化对该亚单位疫苗与标准抗原的影响是一致的。经过终浓度不小于0.125%的去垢剂裂解后，利用SIRD的方法以标准抗原作为参考品来测定该工艺条件下生产的亚单位疫苗的血凝素含量能够得到稳定而准确的结果。去垢剂终浓度由0增加到2%时完整病毒SRID沉淀圈直径增加了5.2 mm，而亚单位疫苗与标准抗原的沉淀圈仅增加了2.9 mm和2.8 mm。可见，去垢剂浓度的变化对完整病毒的作用最为显著。当利用SRID的方法以标准抗原作为参考品来测定完整病毒中的血凝素含量时，样本处理所需要的去垢剂终浓度不应小于1%。
2.2 裂解时间的比较
标准抗原稀释为四个浓度与稀释的亚单位疫苗原液共同进行三组裂解时间的比较，SRID测得的沉淀圈直径见表1。
利用SRID的沉淀圈直径与抗原浓度呈线性的关系分别对3组裂解时间所得到的结果做标准曲线，然后将3组中分别测得的完整病毒液2和亚单位疫苗原液2的沉淀圈直径代入公式中，计算其血凝素含量，见表2。
由表1和表2可见，标准抗原和亚单位疫苗SRID沉淀圈直径均不随裂解时间的变化而发生显著变化。因此，在3组裂解时间下分别测得的完整病毒液血凝素含量(CV=0.2%)和亚单位疫苗原液血凝素含量(CV=1.3%)的结果都是一致的。
3 讨论
单向免疫扩散(SRID)实验应用于流感病毒血凝素含量的检测是一种非常成熟、有效的方法，该方法具有灵敏度高、精确性好、重复性好等优点，是《中国药典》2010年版三部中用于流感病毒疫苗血凝素含量检测的标准方法。而该方法中，样本裂解的充分与否是影响测定结果准确性的重要因素。
本文以流感病毒疫苗生产过程中不同生产阶段的中间产品作为样本，研究了利用单向免疫扩散法测定样本血凝素含量时去垢剂的影响。本研究的结果表明，完整病毒或亚单位疫苗以终浓度1%的去垢剂对抗原样本进行30 min的裂解处理后，均能在单向免疫扩散实验中得到稳定准确的结果。去垢剂浓度低于1%时，完整病毒裂解不充分，进行单向免疫扩散所得的沉淀圈偏小；而去垢剂浓度高于1%时，完整病毒和亚单位疫苗的SRID沉淀圈直径均不随去垢剂浓度的增加而发生变化。此外，裂解时间的延长不会对血凝素含量的测试结果产生影响。
完整病毒未经过裂解，抗原颗粒较大，在SRID中不易扩散；亚单位疫苗经过了一定的裂解处理，抗原颗粒较小，相对于完整病毒颗粒更易于扩散；而亚单位疫苗经去垢剂处理后可进一步裂解为颗粒更小的抗原物质，在SRID中最易扩散，裂解剂浓度比较的实验结果也充分证明了这一点。标准抗原与亚单位疫苗相似，也需要经去垢剂裂解后进行SRID。
在大规模流感病毒疫苗生产的质量控制工作中，经常需要对大量的不同阶段中间产品样本进行检测。利用本研究所确定的样本处理条件，可同时对多种待测抗原样本进行血凝素含量的测定，对于提高工作效率、缩小实验间误差、节约实验成本等方面都具有非常重要的意义。
[参考文献]
[1] Valentine RC，Isaacs A. The structure of influenza virus filaments and spheres[J]. J Gen Microbiol，1957,16(1)：195-204.
[2] Choppin PW，Murphy JS，Stoeckenius W. The surface structure of influenza virus filaments[J]. Virology，1961，13(4)：548-550.
[3] Wang CC，Chen JR，Tseng YC，et al. Glycans on influenza hemagglutinin affect receptor binding and immune response[J] ......
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