蛇床子素逆转人膀胱肿瘤T24/ADM细胞耐药作用及其机制(2)
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1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 细胞 细胞系T24由山西省肿瘤医院实验室提供，T24/ADM细胞为山西医科大学第一医院泌尿外科实验室提供。
1.1.2 试剂 OST购自中国药品生物制品鉴定所；ADM、FU及DDP购自深圳万乐药业股份有限公司；二甲基亚砜(dimethyisufoxide，DMS)、RPMI-1640培养液、四甲基偶氮唑蓝(MTT)及FITC P-gp单克隆抗体购自美国Sigma公司。
1.2 实验方法
1.2.1 细胞培养 将T24接种于含10%小牛血清的RPMI 1640 培养基(内含青、链霉素各100 U/L)，恒温37℃、5% CO2培养箱内传代培养。T24/ADM细胞接种于10%小牛血清的RPMI 1640培养液中传代培养，在培养体系中加入浓度为1.0 μg/mL的ADM以维持耐药性，培养条件同T24细胞，实验前停药至少2周。
1.2.2 MTT法测定蛇床子素的直接细胞毒性试验 实验前2周将T24/ADM细胞置于培养液中培养，取对数期细胞，制备细胞悬液，调整浓度为1×104/mL，接种于96 孔板内，每孔加入200 μL(2×103个细胞/孔)细胞悬液，预培养24 h后，更换为含不同浓度OST的培养液180 μL/孔。分组实验。(1)实验组加入不同体积的OST(使终浓度分别为5、10、20、40、60、80、160 μmol/L；(2)对照组加入等体积的培养液和T24/ADM细胞；(3)空白组无细胞只加等体积的培养液。作用48 h后，行MTT法，酶标仪测定每孔OD490 nm值，计算细胞生长抑制率(IR)。抑制率(%)=(1-实验组OD值/ 对照组OD值)×100%。以抑制率为纵坐标，药物对数浓度为横坐标轴绘制该细胞株的药物剂量—效应曲线图，同时计算细胞生长抑制50%的药物浓度(IC50)值及细胞生长抑制10%的药物浓度(IC10)值，确定生长率>90%的药物浓度作为逆转浓度。
1.2.3 MTT法检测T24/ADM细胞多药耐药性 取对数生长期T24和T24/ADM细胞以2.5×104/mL分别接种于96孔培养板，培养过夜后分别加浓度为0.01、0.1、1、10 μg/mL的化疗药ADM、FU及DDP，实验分组如下：(1)细胞分组，T24和T24/ADM两组，(2)实验分组，实验组为3个药物组 (180 μL细胞悬液+20 μL药物)、对照组(180 μL细胞悬液+20 μL细胞培养液)、空白对照组(200 μL细胞培养液)。药物作用24 h，行MTT法，通过由IR分别对ADM、FU及DDP浓度做剂量效应曲线，分别求出细胞生长抑制50%的ADM、FU及DDP浓度，即IC50。计算各药耐药倍数，耐药倍数=耐药细胞IC50/敏感细胞IC50。
1.2.4 MTT法检测OST的多药耐药逆转作用 取对数生长期T24/ADM细胞以细胞密度2.5×104/mL分别接种于96孔板内，培养过夜，实验分如下3组进行，实验组：17 μmol/L的OST分别与浓度为0.01、0.1、1、10 μg/mL的化疗药的ADM、FU及DDP联用，作用于T24/ADM细胞。对照组：不含OST，单独不同浓度梯度的ADM、FU及DDP联用，作用于T24/ADM细胞。空白组：不含细胞的培养基。实验操作同前，每组设3个复孔。药物作用24 h后，利用MTT法，做抑制率曲线。计算逆转倍数，逆转倍数=耐药细胞逆转前IC50/耐药细胞逆转后IC50。
1.2.5 蛇床子素对T24/ADM细胞表面P-gp表达的影响 T24/ADM细胞分实验组(OST+T24/ADM细胞)和对照组，取对数生长期的细胞105/mL，OST作用72 h后收集细胞，用胰酶将T24/ADM细胞消化成细胞悬液(4×105个/mL)，用PBS洗2次，75%乙醇固定至60 min，离心吸弃乙醇固定液，PBS洗2次，加FITC标记的P-gp单克隆抗体，室温避光孵育30 min，上机检测荧光强度得出P-gp阳性表达率。实验重复3 次，取平均值。
1.3 统计学处理
用SPSS 17.0软件进行数据处理，以t检验、单因素方差分析比较两组和多组间的(x±s)；线性相关与直线回归分析两个变量之间的相互关系。
2 结果
2.1 蛇床子素对T24/ADM细胞毒性试验
蛇床子素能够抑制T24/ADM细胞生长，抑制作用随着药物剂量的增加而增强，呈剂量依赖关系，抑制率与药物浓度呈正相关，通过直线回归法分析出OST浓度(x)与抑制率(y)，y=-1.717 4+0.676 1x，计算OST的IC50为76.49 μmol/L及IC10为17 μmol/L，提示17 μmol/L浓度或者更低浓度的OST对T24/ADM无明显细胞毒性作用，故将该浓度段的蛇床子素作用认为是无毒效应。故选OST浓度为17 μmol/L作为逆转剂量。
2.2 T24/ADM对ADM、FU及DDP的多药耐药性
结果见表1，ADM，FU及DDP对T24/ADM的IC50明显高于T24，两者相比较差异有统计学意义(P < 0.01)，表明T24/ADM呈现多药耐药，可以作为研究耐药逆转的细胞系。
2.3 蛇床子素对T24/ADM细胞药敏性的影响
结果见表2，加入OST后ADM，FU及DDP对T24/ADM的IC50均明显降低(与加入前相比较，P < 0.01)。
2.4 蛇床子素对不同细胞表面P-gp表达的影响
OST作用前后，P-gp蛋白表达的荧光强度值分别为(92.13±0.31)和(75.71±0.42)，两者间差异有统计学意义(P < 0.05)。见表3。
3 讨论
MDR是化疗失败的主要原因，克服肿瘤细胞的MDR，增加肿瘤对化疗药物的敏感性，提高化疗药物的疗效已经成为肿瘤化疗亟待解决的关键性问题，具有重要的临床意义。体外被证实有逆转活性的药物有很多，如环孢霉素，异搏定等，但由于他们对心、肾的毒性，限制它们在临床应用价值。因此国内外学者正积极从天然植物中寻找高效，低毒的多药耐药逆转剂，药理学研究证实理想的MDR逆转剂应具备毒副作用低而本身有抗癌活性两个基本特点。近年来国内外有关蛇床子素及其他香豆素成份的药理研究获得了很大进展，尤其是在抗诱变、抗肿瘤作用方面的突出作用及特点为其在肿瘤的预防和配合抗肿瘤药物应用方面展示了新的前景，资料显示蛇床子素对人类白血病(HL-60)、宫颈癌(Hela)、结肠癌(Colo205)细胞有很强的抑制作用[7-9]。以BALB/C裸鼠为实验对象，观察到蛇床子素可抑制肺鳞癌和肺腺癌癌体的生长(抑瘤率分别为60.9%和50%)[10]；以小鼠为研究对象 ......
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