盐酸二甲双胍对成骨细胞增殖、BMP-2及Cbfa-1基因表达的影响(2)
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1.2.4 盐酸二甲双胍对成骨细胞BMP-2及Cbfa-1 mRNA的表达的影响
不同浓度的二甲双胍(0、50、100、200、400 μmol/L)作用于成骨细胞24 h后，弃去培养基应用Trizol法提取细胞总RNA。
逆转录反应条件参照试剂盒说明。PCR反应体系为：cDNA 5.0 μL，FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)25.0 μL上下游引物各0、5 μL，用DEPC-H2O补足至50 μL体积。PCR反应条件：95℃预变性30 s，95℃变性5 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 rain，40个循环。以GADPH 为管家基因，对照孔(无二甲双胍)为校正值，采用2-△△Ct法计算基因表达的相对变化。△△Ct =(Ct目的基因-Ct管家基因)待测样本-(Ct目的基因-Ct管家基因)校正样本，校正样本是任何被选作代表1倍目的基因表达量的样本。以上实验重复3次，每组设3孔重复。引物序列见表1。
1.3 统计学处理
应用SPSS 17.0统计学软件对实验数据进行分析，数据以均数±标准差表示。各组总体上有无差别采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD法分析，P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 成骨细胞的形态观察及鉴定
经酶消化法分离纯化的乳鼠成骨细胞贴壁前成球形，贴壁后细胞成梭形、三角形或不规则的多边形，胞核呈圆形或椭圆形，居中或偏于一侧。成骨碱性磷酸酶染色后，多数的细胞核及细胞质形成灰黑至深黑色颗粒状或片状沉淀显示强阳性。茜素红染色后呈大小形态不一的红色阳性结节。以上结果均符合成骨细胞的特性。
2.2 成骨细胞的增殖能力(MTT法)
结果表明，随着二甲双胍浓度的增加，各组OD值增高，呈浓度依赖性。实验组与对照组、实验组组间比较，差异均有统计学意义(P < 0.05)。见表2。
2.3 盐酸二甲双胍对成骨细胞BMP-2、Cbfa-1基因表达的影响
对照组(0 μmol/L)BMP-2、Cbfa-1的mRNA表达为1。BMP-2和Cbfa-1 mRNA表达随盐酸二甲双胍浓度的增高而升高，并且呈剂量依赖性，与对照组相比，实验组BMP-2和Cbfa-1 mRNA的表达差异有统计学意义，说明不同浓度的二甲双胍作用成骨细胞24 h后能促进成骨细胞BMP-2和Cbfa-1 mRNA的表达。详见表3。
3 讨论
糖尿病是一种最常见的内分泌代谢性疾病。随着人口的老龄化和人民生活水平的提高，其发病率和患病率逐年增加。根据报道[2]有1/2～2/3的糖尿病患者伴有骨密度减低，其中1/3的患者可诊断为骨质疏松症。因此研究降糖药物对骨代谢的影响对治疗糖尿病合并骨质疏松患者具有重要的临床意义。
二甲双胍(MF)从问世至今，已经走过了50年的历程，因其具有抑制肝葡糖糖输出，增加外周组织对胰岛素的敏感性等多方面的药理作用，已被广泛应用于2型糖尿病、多囊卵巢综合征、肥胖等代谢性疾病的治疗。本研究观察二甲双胍对原代颅盖骨成骨细胞增殖、BMP-2和Cbfa-1 mRNA表达的影响，探讨其可能的机制。
本研究采用不同浓度的MF刺激成骨细胞24 h后，MTT结果显示：MF在一定浓度范围(50～400 μmol/L)呈浓度依赖性地促进成骨细胞增殖，并且400 μmol/L达到最大效应。其结果与Cortizo AM[3]、吕娇等[4]的报道相一致。
BMP家族是一种广泛存在于骨基质中的酸性糖蛋白，具有诱导成骨细胞分化和诱导体外成骨能力。因其具有独特的异位骨诱导活性而被命名为骨形态发生蛋白，是目前研究骨形成的主要细胞因子。BMP-2是BMP家族中起重要作用的一员，BMP-2是目前公认的高效骨诱导因子。故对于衡量成骨细胞的成骨能力，BMP-2的合成是一个非常重要的指标。Kanazawa L等[5]研究表明，在MC3T3-E1成骨细胞系，二甲双胍可以显著增加Ⅰ型胶原、骨钙素、骨形态发生蛋白-2(BMP-2)和eNOS的表达量，提高碱性磷酸酶的活性，促进矿化结节的形成。本实验显示不同浓度的二甲双胍作用成骨细胞24 h后，可以促进成骨细胞BMP-2的表达。由此推测，二甲双胍可能是通过增加BMP-2的表达，促进成骨细胞的成骨能力，增加骨强度。
核心结合因子(Cbfa-1)作为第一个被识别的成骨细胞特异性转录因子，在成骨细胞系分化和成熟过程中起重要作用，对成骨细胞的分化和骨形成十分必要[6]。在鼠中剔除Cbfa-1基因可导致成骨细胞分化完全受抑制，使骨骼的软骨内骨化成骨和膜内骨化成骨均不能发生[7]。Gao Y等[8]用二甲双胍干预双侧卵巢切除的大鼠，结果发现用二甲双胍治疗后的大鼠胫骨骨密度较对照组有所增加，RT-PCR证实二甲双胍治疗组胫骨成骨细胞Cbfa-1的表达升高。Zhen D等[9]在二甲双胍干预的大鼠颅骨成骨细胞中也发现，Cbfa-1的表达增加。本研究表明二甲双胍作用于成骨细胞后可以促进成骨细胞Cbfa-1 mRNA的表达，在50～400 μmol/L呈剂量依赖关系，以400 μmol/L作用最明显。
综上所述，体外培养的实验表明，二甲双胍可以通过促进BMP-2和Cbfa-1 mRNA表达对骨代谢产生影响，可能降低糖尿病患者的骨质疏松发生率，但其具体的机制仍需要进一步研究。因此要用于骨代谢疾病的治疗，还有相当长的一段路要走。
[参考文献]
[1] Vestergaard P，Ronrnark L，Mosekilde L. Relative fracture risk in patients with diabetes mellitus and the impact of insulin and oral anti-diabetic medication on relative fracture risk[J]. Diabetologia，2005，48：1292-1299.
[2] 曾祥琴，胡肇衡. 糖尿病与骨质疏松的关系[J]. 中华临床医院研究杂志，2006，12(10)：1394.
[3] Cortizo AM，Sedlinsky C，McCarthy AD，et al. Osteogenic actions of the anti-diabetic drug metformin on osteoblasts in culture[J]. Eur J Pharmacol ......
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