五味子乙素在大鼠体内药代动力学的性别差异(1)
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[摘要] 目的 研究五味子乙素在不同性别大鼠体内药代动力学的差异。 方法 雌、雄大鼠均灌胃给药(100 mg/kg)后，测定五味子乙素的血药浓度。 结果 雌性大鼠体内的血药浓度显著高于雄性大鼠，生物利用度比雄性大鼠高约3倍，消除半衰期比雄性大鼠长。 结论 五味子乙素在不同性别的大鼠体内药代动力学特征具有明显差异。
[关键词] 五味子乙素；高效液相色谱；药代动力学；性别差异
[中图分类号] R914[文献标识码] A[文章编号] 1674-4721(2012)03(b)-0011-03
木兰科植物五味子(Schisandra chinensis(Turcz.)Baill.)具有补肾宁心、收敛固涩、益气生津等功效[1]。陈延镛等[2]较早对五味子进行了系统研究，证明其主要有效成分是木质素类。木质素类成分具有挥发性，因此笔者采用超临界CO2萃取得到五味子挥发油[3]，以供试验用，具体制法本文不再赘述。五味子挥发油包含五味子中大多数有效成分，有镇静、保肝、扩血管、抗衰老、祛痰和镇咳等作用[4-5]，而五味子乙素是最重要的有效成分，具有多种药理活性[6-9]。魏斌斌等[10]曾对五味子乙素在大鼠体内进行了药代动力学研究，但没有发现其药代动力学的性别差异。Tie Zhao等[11]发现了五味子乙素在大鼠体内药代动力学的性别差异，并采用单纯集聚数据分析法进行了初步研究。由于中药、天然药物非临床药代动力学研究未出台相应的技术指导原则，本文参照国家食品药品监督管理局颁布的《化学药物非临床药代动力学研究技术指导原则》要求“动力学研究最好从同一动物多次取样，尽量避免用多只动物合并样本”，进一步对五味子乙素在大鼠体内的药代动力学特征进行随机分组对照试验。
1 仪器和试药
1.1 仪器
LC-10 AT型液相色谱仪配SPD-10 A型紫外检测器(日本岛津公司)；Anastar色谱工作站(奥特塞恩斯仪器有限公司)。
1.2 试药
内标黄体酮和五味子乙素对照品均购自中国药品生物制品检定所，批号分别为：1173-040110和100027-200307；乙腈和甲醇为色谱纯；水为重蒸馏水，其他试剂均为分析纯；肝素钠由天津市生物化学制药厂生产，批号：20101115。
1.3 实验动物
体重180～220 g的Wistar大鼠，雌性6只，雄性6只，由沈阳药科大学实验动物中心提供。
2 方法与结果
2.1 色谱条件和系统适用性试验
色谱柱：迪马C18柱 (250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：乙腈-水(80∶20)；流速1.0 mL/min；检测波长250 nm；进样量为20 μL。在此色谱条件下，五味子乙素色谱峰与相邻色谱峰分离度均大于1.5，拖尾因子在0.95~1.05之间，理论塔板数大于8 000，符合测定要求。
2.2 对照品溶液和内标溶液的制备
2.2.1 对照品溶液取五味子乙素对照品，精密称定，用甲醇溶解得126.0 mg/L的标准储备液，再于不同的量瓶中用甲醇稀释成五味子乙素浓度分别为0.404、0.756、1.512、3.150、6.300、8.190、12.600 mg/L的系列对照品溶液，4℃保存备用。
2.2.2 内标溶液取黄体酮对照品，精密称定，用甲醇溶解得125 mg/L内标储备液，再用甲醇稀释成5 mg/L的内标溶液，4℃保存备用。
2.3 血浆样品预处理
将200 μL大鼠血浆样品置1.5 mL的离心管中，依次加入内标溶液20 μL，乙腈400 μL，涡旋3 min，再以8 000 r/min离心10 min，分离出上清液，用氮气吹干，再用甲醇100 μL复溶，涡旋混合5 min，然后8 000 r/min离心10 min，取上清液20 μL进样测定。
2.4 专属性试验
空白大鼠血浆样品、空白血浆+对照品+内标、灌胃2.5 h后的血浆样品+内标的典型色谱图见图1。由图可见，五味子乙素和内标的测定不受杂质干扰。
2.5 标准曲线和定量下限
取空白血浆200 μL多份，分别加入五味子乙素系列对照品溶液各20 μL，再在每份样品中各加黄体酮溶液20 μL，得到五味子乙素浓度分别为40.40、75.60、151.20、315.00、630.00、819.00、1 260.00 μg/L的对照品血浆样品。在上述条件进样测定，以五味子乙素与内标峰面积的比值Y(Ai/As)为纵坐标，五味子乙素的浓度X为横坐标，1/X2为权重系数，用加权最小二乘法[12]进行线性回归运算并绘制标准曲线，典型的回归方程为：Y = 0.002 3X-0.032 3，r ＝ 0.998 6(n ＝ 7)。结果表明，五味子乙素血浆样品在40.40～1 260.00 μg/L范围内线性关系良好。当信噪比(S/N)为10时，本方法的定量下限可达40.40 μg/L。
2.6 精密度与准确度
取空白大鼠血浆，按标准曲线项下方法配制低、中、高3个浓度(75.60、315.00、1 008.00 μg/L)的五味子乙素血浆样品，每个浓度6样本分析，连续测定3 d。结果，低、中、高3个浓度的日内精密度(RSD)分别为4.68%、4.32%、6.29%，日间精密度(RSD)分别为6.59%、7.40%、9.86%。
2.7 回收率试验
2.7.1 相对回收率试验将“精密度与准确度”项下测得的低、中、高3个浓度的对照品血浆样品溶液峰面积代入当日回归方程，计算五味子乙素的质量浓度，与相应实际量比较，得低、中、高3个浓度的平均相对回收率分别为95.92%、99.04%和101.30%。
2.7.2 绝对回收率试验取甲醇(代替空白大鼠血浆)200 μL，按“标准曲线和定量下限”项下方法处理，制成低、中、高3个质量浓度(75.60、315.00、1 008.00 μg/L)的五味子乙素血浆样品，进样测定得到3种浓度五味子乙素的峰面积和内标的峰面积，每个水平重复6次。将“精密度与准确度”项下测得的低、中、高3个水平的对照品血浆样品溶液各峰面积与上述测定的峰面积进行比较。结果，低、中、高3个水平五味子乙素的绝对回收率分别为65.41%、66.47%、63.75%。
2.8 稳定性试验
取空白大鼠血浆，同上处理得低、中、高3个浓度(75.60、315.00、1 008.00 μg/L)的对照品血浆样品，用3个浓度考察3次冷冻融解循环、常温放置24 h以及-20℃冷藏14 d后对照品的稳定性，每个浓度在同一条件下分析6个样本。结果3种条件下测得对照品浓度的RE%均在±8%之内，表明样品在上述条件下稳定性良好，可以满足测定的需要。
2.9 药代动力学研究
2.9.1 灌胃液的制备取0.5 mL聚吐温-80和4 g五味子挥发油，置于25 mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀即得。HPLC法测定五味子乙素浓度为10.2 mg/mL。
2.9.2 给药方法Wistar大鼠12只，按照性别分成两组。实验前禁食1 h，自由饮水，口服给予灌胃液适量(相当于五味子乙素100 mg/kg)，分别于给药前和给药后，雌性各组分别于0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、2.5、3、4、5、6、8、10、14 h眼眶后静脉丛取血0.4 mL，雄性各组分别于0.25、0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、5、6、8 h同法取血。置于肝素化的锥形离心管中，4 000 r/min离心10 min，分离血浆，-20℃存放备测。, 百拇医药(徐国防 李爽 游广辉 李晓苏)