HA作为药物载体合成HA-TGF-β1缓释剂对自体兔耳软骨移植影响的实验研究(2)
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参见附件。
1.1.2 主要试剂 人重组TGF-β1( Peprotech公司，美国)，HA(Sigma公司，美国)，脱毛剂(购自武汉博士德生物技术有限公司)，EDTA(购自武汉博士德生物技术有限公司)，木瓜蛋白酶(merck公司, 德国)，乙酸钠溶液(北京索莱宝公司)，4-硫酸软骨素(Sigma公司，美国)，阿利新蓝8GX(Fluka，美国)，HE染色及免疫组化所需试剂材料(均由山西医科大学寄生虫学教研室提供)。
1.1.3 主要仪器 恒温箱，离心机，可见紫外分光光度计(均由山西医科大学寄生虫学教研室提供)。
1.2 实验动物研究时间及分组
从2011年9月1日~12月1日，将32只家兔随机分成2周组、4周组、8周组及12周组4个组别，每组8只。
1.3 动物模型的制备
用速眠新Ⅱ注射液后肢肌内注射(0.2 mL/kg)麻醉后，耳部常规消毒，在避开内外耳缘静脉及动脉处的部位取包括软骨膜的软骨组织1 cm×1 cm 4块，软骨入0.9%氯化钠溶液浸泡数分钟，取材处加压止血，然后在兔背部左右两侧用脱毛剂脱去2 cm×2 cm的4个区域，常规消毒后，分离出4个肉膜下的近肌肉层的皮下腔，分别植入已取好的四块软骨，切口分肉膜层和皮肤层用3-0丝线间断缝合。然后各植入腔内分别按既定顺序注射NS 2 mL、HA (100 μg/L) 2 mL、TGF-β1(10 ng/mL)2 mL、TGF-β1(10 ng/mL)+ HA (100 μg/L)混合液2 mL。切口处消毒。麻醉苏醒后，将兔分笼饲养，定期观察各指标。每只兔子肌注青霉素400 000 U，每日1次，连续5 d。每只兔子切口处换药，每日1次，连续7 d。
1.4 取材
在术后2, 4, 8, 12 周用耳缘静脉空气栓塞法处死相应组别的兔子，分别取出各移植软骨组织作为样本进行各指标的检测。
1.5 HE染色及Ⅱ型胶原免疫组织化学检测
将取下的部分软骨用10%福尔马林固定1周，然后15%EDTA在恒温箱中脱钙1个月,每天更换脱钙液1次，以大头针能无阻力刺进软骨组织为完成脱钙标准。随后常规脱水透明，石蜡包埋，切片6 μm，脱蜡至水，然后一部分组织行HE染色，另一部分组织检测Ⅱ型胶原的表达，Ⅱ型胶原单克隆抗体作为第一抗体，按照免疫组化SABC法操作步骤进行DAB显色，苏木素复染充分吹干切片后，透明树胶封片。
1.6 阿利新蓝比色法检测细胞外基质GAG含量
1.6.1 方法 将取下的备用软骨组织冻于-20℃。采用曹谊林等[2]的方法用阿利新蓝比色法检测细胞外基质GAG含量。
1.6.2 基本原理 GAG与阿利新蓝可以迅速生成可溶性的GAG-阿利新蓝复合物。由于GAG-阿利新蓝复合物与阿利新蓝具有不同的光吸收，可用比色法测出GAG-阿利新蓝复合物的含量，从而得知GAG的含量。
1.6.3 试剂的配制 阿利新蓝8GX染液：将阿利新蓝8GX按1.4 mg/mL(W/V)溶解于0.5 mol/L乙酸钠溶液中(用前临时配制)。
1.7 统计学分析
采用 SPSS 13.0 统计软件包进行分析, 细胞外基质GAG含量数据以x±s表示。多组比较采用单因素方差分析，P < 0.05为有统计学意义。
2 结果
2.1 HE染色及Ⅱ型胶原免疫组织化学检测
2.1.1 软骨组织中软骨细胞增殖与退变及边缘细胞活力观察
见图1。HE染色观察显示，2周时HA-TGF-β1组与TGF-β1组可见到少量幼稚软骨细胞，周围有炎细胞浸润。4周时HA-TGF-β1组与TGF-β1组可见幼稚软骨细胞及细胞层数增加，外周炎性细胞浸润有所减轻。2周与4周时NS组与HA组未见新生软骨细胞，周围有炎细胞浸润，移植软骨以退变为主。8周时HA-TGF-β1组与TGF-β1组有新生软骨细胞及软骨陷窝形成，软骨细胞大部分成熟，包埋在软骨陷窝内；NS组与HA组可见软骨细胞层数增加，相当于4周时的HA-TGF-β1组。 12周时HA-TGF-β1组与TGF-β1组软骨细胞完全成熟，分布均匀，结构恢复正常，包埋在软骨陷窝内；HA组与NS组替代过程非常活跃，软骨细胞排列结构未完全恢复，表现为8周时的HA-TGF-β1组。
2.1.2 Ⅱ型胶原免疫组化染色 见图2。软骨细胞胞浆染成棕黄色，可见黄褐色颗粒状物质沉积，胞核不着色。检测结果显示，在2周时的NS组和HA组Ⅱ型胶原免疫组化呈强阳性表达, 至4周时呈弱阳性；在2周、4周与8周时的TGF-β1组Ⅱ型胶原免疫组化呈强阳性表达，至12周时呈弱阳性；12周时的HA-TGF-β1组的Ⅱ型胶原免疫组化仍呈强阳性表达。
2.2 细胞外基质GAG含量检测
见表1。与NS组和HA组相比，HA-TGF-β1组和TGF-β1组的细胞外基质GAG含量均有明显增加(P < 0.05)，HA-TGF-β1组的GAG分泌量分别高于TGF-β1组、HA组与NS组(P < 0.05)。与TGF-β1组相比，HA-TGF-β1组的细胞外基质GAG含量有明显增加(P < 0.05)。随着时间的延长，时间越长的组别GAG含量增加越明显(P < 0.05)。4周时的各组比2周时的各组GAG含量均有明显增加(P < 0.05)，8周时的各组比4周时与2周时的各组GAG含量均有明显增加(P < 0.05)，12周时的各组比8周时、4周时与2周时的各组GAG含量均有明显增加(P < 0.05)。
3 讨论
软骨组织中没有血管或神经，靠吸取周围组织液中的营养而成活。软骨细胞是软骨组织中唯一的细胞类型，位于软骨陷窝中，包埋在软骨基质中。软骨有两种并存的生长方式：一种是间质生长，又称软骨内生长，通过软骨细胞的分裂增殖，不断的产生基质和纤维，使软骨从内部增大，另外一种是外加生长，又称软骨膜下生长，通过软骨膜内层的骨原细胞在软骨组织表面分裂分化形成软骨细胞，并不断产生基质和纤维，使软骨逐层增厚，从表面向外扩大。软骨膜的作用[3]：(1)软骨膜能阻止结缔组织侵入受区；(2)软骨膜能保留软骨细胞的活力，促进愈合；(3)内层软骨膜能防止吸收，具有保护功能；(4)软骨膜能促进新软骨形成。李太颖等[4]认为有软骨膜覆盖的边缘部位，无明显的软骨被结缔组织侵蚀现象。本实验采用带软骨膜的软骨进行移植，其研究结果显示：在移植软骨断端边缘有出现新生软骨细胞，替代过程很活跃。
已有实验证明TGF-β1具有促进软骨细胞增殖，调节其分化和细胞外基质合成的能力[5]。细胞外基质(ECM)是细胞附着的基本框架和代谢场所，是维持细胞正常生存、分化和运动的外环境。有实验研究表明在体外培养软骨细胞随传代次数的增加，软骨细胞会发生去极化现象，即原来分泌Ⅱ型胶原，现在分泌Ⅰ型胶原，丧失了软骨细胞的能力；软骨细胞在体内为圆形，原代为圆形或多角形，传代后逐渐为长梭形，类似于成纤维细胞。在本实验条件下TGF-β1组及HA-TGF-β1组作用下的软骨细胞能够大量合成、分泌特异性胶原，从而证明了其在作用于移植软骨后可使软骨细胞能够维持其功能特性 ......
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