胶原海绵促进肉芽生长与创面愈合实验研究(2)
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参见附件。
1.2 测试指标及方法
1.2.1 创面面积愈合率(%)：通过数码相机行平行于创面照相，造模时及造模后3、7、14 d 3个时相点以image J软件测定计算摄片的创面面积测试出取材时创面面积[3]，创面面积愈合率(%)=(造模时创面面积-取材时创面面积)/造模时创面面积×100。并记录创面愈合的时间(d)。
1.2.2创面毛细血管密度测定：造模后3、7、14 d 3个时相点对实验动物进行创面边缘至创面中心的宽1 cm修复组织，固定后行HE染色用普通光镜观察，在400倍数下，各组标本任取3个视野，计数每个视野内毛细血管的数目，取均值作为创面毛细血管密度。
1.2.3肉芽内血红蛋白含量：取血红蛋白标准品作血红蛋白标准曲线，创面肉芽取出称重后，加入2 mL0.9%氯化钠溶液，震荡20 min洗出肉芽内血液,以分光光度仪测定其510 nm吸收峰值，与标准曲线对照后测出血红蛋白含量。
1.2.4 羟脯氨酸含量：将创面肉芽取出称重后，予以匀浆后离心，加入试剂后，测试方法同血红蛋白含量，以分光光度仪测定其550 nm吸收峰值。
1.2.5 统计学处理：采用SPSS统计学软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用t检验，率的检验采取χ2检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1兔背部机械性创面愈合率
创面愈合率：造模后3、7、14 d各组创面面积均明显减小；造模后第3天，可即邦胶原、艾薇停微纤维止血胶原组较凡士林纱布组创面愈合率提高1倍左右；之后创面愈合速度均有所减缓，但实验各组仍然显著高于对照组(P < 0. 01)，可即邦胶原海绵又显著高于其他两组(P < 0. 05)，第14天时，可即邦胶原海绵创面愈合率达78%，而艾薇停微纤维止血胶原为74%，对照组仅为66%，差异具有统计学意义。创面愈合时间，可即邦胶原平均为17.7 d，比艾薇停微纤维止血胶原提前1 d，比对照组提前近5 d。差异有统计学意义。见表1。
2.2 兔背部机械性创面毛细血管密度
兔背部创面覆盖胶原海绵，创面出血量少，很快形成一层凝血膜，于3、7、14 d分别创面中心的肉芽组织，HE染色，血管计数，未取材之创面予以更换辅料及胶原海绵。结果显示创面毛细血管密度于7 d时达顶峰，之后下降。治疗组1与治疗组2显著高于对照组。在3 d与7 d时疗效显著，较对照组多50%~80%，14 d时仍有差异，但已下降到20%左右。在7 d时，治疗组1高于治疗组2，差异有统计学意义。具体见表2。
2.3兔背部机械性创面愈合肉芽中血红蛋白含量
造模后3、7、14 d各实验组血红蛋白含量均显著高于对照组(P < 0.01)；实验各组中，造模后3、7 d时，可即邦胶原海绵组明显高于艾薇停微纤维止血胶原组，而造模后14 d时，治疗组则高于对照组，差异具有统计学意义。见表3。
2.4 兔背部机械性创面愈合肉芽中羟脯氨酸含量
造模后3 d起，各组造模后肉芽组织内羟脯氨酸含量开始升高，至14 d时达到顶峰，说明机体创面肉芽生长，胶原合成。第3天，胶原海绵组相对对照组肉芽组织内羟脯氨酸含量显著提高(P = 0. 05及0. 004)，治疗组之间无明显差别，造模后第7及14天，各治疗组均极显著高于对照组，对照组14 d时相当于治疗组7 d时的含量；14 d时，可即邦胶原海绵高于艾薇停微纤维止血胶原海绵组(P = 0. 014)，差异有统计学意义。见表4。
3 讨论
胶原是细胞外基质的主要成分，应用于创面，组织相容性好、同时直接提供创面营养。临床与实验研究表明，胶原海绵局部外用于创面，具有促进创面愈合、美容与肉芽生长的疗效[4-5]。然而有关含不同密度胶原蛋白的胶原对创面愈合影响的实验研究尚未见报道。本研究首先从血管新生与胶原合成方面探查胶原海绵外用对创面的愈合作用，同时比较胶原海绵中胶原蛋白的含量差异对创面愈合的影响。
创面愈合率及愈合时间是创面愈合的金标准。本研究结果显示胶原海绵可以显著提高创面愈合率及缩短愈合时间，刘艳明等[6]研究采用的胶原海绵治疗烧伤创面，胶原海绵2周时愈合率为24%，对照组凡士林纱布为10%，与本文采用机械性创面治疗后3 d时的结果一致，可能是机械性创面去除了烧伤创面炎症与坏死等因素；治疗组在创面愈合率及愈合时间方面均显著优于对照组，本研究结果与其一致。组织的修复要经历炎症、增殖、塑形三个阶段，其中增殖阶段包括血管新生与胶原合成，本研究显示胶原海绵提高创面肉芽血管新生与胶原合成显著促进创面肉芽增殖，笔者前期研究也发现胶原能促进血管新生[7]。
本研究进一步评价含胶原纤维较多的可即邦胶原海绵与含胶原纤维较少的艾微停微纤维止血胶原对创面愈合的疗效，相同体积两种胶原的重量分别为5 g与0.5 g，相差10倍。本实验发现可即邦胶原海绵在7 d时的创面愈合率与总的愈合时间优于艾微停微纤维止血胶原，同时7 d时的血管新生及血红蛋白含量与14 d时羟脯氨酸含量高于艾微停微纤维止血胶原，显示出胶原纤维含量较多可能对创面愈合有利。笔者认为首先是因为含胶原较多的海绵降解时，可以有大量的胶原氨基酸释放至创面，而氨基酸对创伤组织和细胞再生提供了必要的良好条件[4]；此外，研究显示生物材料中孔径大小与血管新生密切相关[8]，笔者推测可即邦胶原海绵的孔径可能更有利于血管内皮细胞的增殖与迁移。
总之，本研究显示出胶原海绵对创面具有促进愈合的疗效，作用机制之一是促进血管新生与胶原合成。含胶原纤维较高的可即邦胶原海绵更有利于创面愈合，而含胶原纤维较少的艾薇停微纤维止血胶原海绵对创面愈合没有止血疗效有优势。今后进一步探查胶原纤维含量对创面愈合的影响可能开发出疗效更佳的胶原海绵产品。
[参考文献]
[1] Martin P. Wound healing-aiming for prefer skin regeneration [J]. science，1997，276(5309)：75-80.
[2] Steffens GCM，Yao C，Prével P. Modulation of angiogenic potential of collagen matrices by covalent incorporation of heparin and loading with VEGF[J]. Tissue Engineering-Oct，2003，10(9-10)：1502-1509.
[3] Rennert R，Golinko M，Kaplan D，et al. Standardization of wound photography using the Wound Electronic Medical Record[J] ......
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