天柏金黄散微生物限度检查方法的研究(2)
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2.2 样品液的制备
称取样品10 g，置锥形瓶中，加pH 7.0无菌NaCl溶液-蛋白胨缓冲液100 mL，振摇混匀，制成样品液(1∶10)备用。
2.3 验证方法
根据以下方法进行3次独立的平行试验，并计算各试验菌的回收率。
2.3.1 常规法 取样品液(1∶10)1 mL注入无菌平皿中，平行制备两个，立即倾注15～20 mL琼脂培养基，于规定的温度培养至规定的时间后计菌落数。
2.3.2 培养基稀释法 取样品液(1∶10)1 mL分注5个无菌平皿，每皿0.2 mL，平行制备两份，立即倾注15～20 mL琼脂培养基，于规定的温度培养至规定的时间后计菌落数。
2.4 试验菌回收率测定
2.4.1 样品试验组 取样品液(1∶10)1 mL分别按常规法和培养基稀释法操作加入规定量的样品液后，于每皿中加入50～100 cfu试验菌1 mL，每种试验菌各平行制备两份，立即注入45℃溶化的相应琼脂培养基15～20 mL，摇匀，待凝固后，将平板倒置于规定的温度培养至规定的时间，测定菌落数。
2.4.2 菌液组 取上述五种菌液各1 mL加入平皿内，立即注入相应琼脂培养基，各菌株做2份平行试验，测定所加入的试验菌落数。
2.4.3 样品对照组(本底组) 分别采用“2.3”项下常规法和培养基稀释法进行操作，按菌落计数方法测定两组样品本底菌落数。
2.5 试验结果
2.5.1 天柏金黄散常规法回收率试验测定结果见表1。
由表1可知，用常规法测定天柏金黄散的微生物限度时，样品对大肠埃希菌、白色念珠菌、黑曲霉菌的回收率试验均达到于70%以上，回收率符合规定要求；而对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的回收率试验均低于70%以下，表明天柏金黄散对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌有抑菌作用，需改用其他方法消除其抑菌作用。
2.5.2 用培养基稀释法(0.2 mL/皿)测定天柏金黄散回收率试验结果见表2。
由表2可知，改用培养基稀释法(0.2 mL/皿)测定天柏金黄散的微生物限度时，通过0.2 mL/皿的培养基稀释后，金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的回收率均达到70%以上，已消除其抑菌作用，回收率符合规定要求，培养基稀释法(0.2 mL/皿)适用于天柏金黄散微生物限度的检查。
2.6 结果
天柏金黄散可用培养基稀释法(0.2 mL/皿)进行微生物限度检查。
3 讨论
中药制剂由多种中药材为原料制成，中药材所含的成分非常复杂，在其微生物限度检查中，任何具有抑菌作用的成分都可能会影响到结果的准确性[2]。因此，从2005年版《中华人民共和国药典》以来，确定了微生物限度检查方法学验证的必要性。对具有抑菌成分的中药制剂细菌数、霉菌数的检查方法，许多文献采用了稀释法、离心沉淀法、薄膜过滤法等方法以消除抑菌干扰[3-10]。实际应用中以培养基稀释法最为常用，本试验采用5种阳性对照菌的回收率试验作为评价标准，建立了天柏金黄散微生物限度检查的方法。
试验证明天柏金黄散用常规法测定时，大肠埃希菌、白色念珠菌和黑曲霉菌回收率均达到70%以上，而对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的回收率均在70%以下，说明制剂具有抑菌作用，试验中尝试使用培养基稀释法(0.2 mL/皿)测定金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌时，回收率均高于70%。因此，培养基稀释法(0.2 mL/皿)可用于天柏金黄散的微生物限度检查。
[参考文献]
[1] 国家药典委员会编. 中华人民共和国药典(一部)[S]. 2010 年版. 北京：化学工业出版社，2010：附录79.
[2] 陈万胜. 药品微生物限度检验误差影响因素分析[J]. 中国当代医药，2011，18(4)：121.
[3] 俞虹，凌明，应佳. 具抗菌活性胶囊剂的微生物限度检查方法及验证[J]. 药物分析杂志，2006，26(9)：1328-1330.
[4] 王琳琳，丁安伟，耿敬军. 药品微生物学检查方法学验证执行状况分析[J]. 医药导报，2007，26(5)：569-571.
[5] 卓小萍，洪美华. 14种中成药微生物限度检查方法验证[J]. 中国药师，2008，4(12)：1473-1475 ......
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