过氧化氢对Hela肿瘤细胞毒性和衰老的影响
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[摘要] 目的 体外实验探讨过氧化氢对Hela肿瘤细胞毒性和衰老的影响。 方法 不同浓度的过氧化氢处理Hela细胞，CCK—8法检测细胞毒性，β—半乳糖苷酶染色法测定细胞衰老，测定平均荧光强度(MFI)反映细胞产生活性氧的水平。 结果 细胞增殖实验显示，400 μmol/L、800 μmol/L、1 600 μmol/L对体外培养的Hela细胞有不同程度的细胞毒性，最高达89.0%。过氧化氢处理后，细胞衰老率和活性氧产生水平随过氧化氢浓度升高而增高，呈现量效关系。 结论 过氧化氢对Hela细胞有明显的细胞毒性，还能诱导其衰老和影响活性氧的产生水平。
[关键词] 过氧化氢；Hela细胞；细胞增殖；细胞衰老；活性氧
[中图分类号] R—33 [文献标识码] A [文章编号] 1674—4721(2012)09(a)—0009—02
现有研究表明，过氧化氢是肿瘤发生、发展和死亡过程的关键事件，通过改变过氧化氢的含量或许能达到化学预防和治疗的目的[1]。本研究旨在探讨过氧化氢对体外Hela细胞的增殖和衰老的影响，为过氧化氢在肿瘤生长中的作用提供参考。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 试剂 小牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)，DMEM(GIBCO，上海英骏生物有限公司)，胰酶细胞消化液(Beyotime)，CCK—8试剂盒(碧云天生物技术研究所)，活性氧检测试剂盒(碧云天生物技术研究所)，细胞衰老β—半乳糖苷酶染色试剂盒(碧云天生物技术研究所)。
1.1.2 仪器 多功能酶标仪(Biotek)，倒置显微镜(OLYMPUS)，荧光显微镜(Leica)，CO2培养箱(RSBiotech)，超净工作台(苏净集团苏州安泰空气技术有限公司)。
1.1.3 细胞株 人宫颈癌Hela细胞株，由广东医学院衰老研究所提供。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养 将人宫颈癌细胞置于含10%小牛血清的DMEM培养液中，在 37℃，饱和湿度，5%CO2培养箱中培养。
1.2.2 过氧化氢处理肿瘤细胞 设置对照组和高、中、低3个剂量实验组，取对数期生长的肿瘤细胞按每孔10 000个细胞接种于48孔培养板，置37℃，5%CO2培养箱培养48 h，高、中、低剂量实验组分别加入不同浓度10 μL过氧化氢溶液，使其终浓度分别为1 600 μmol/L、800 μmol/L和400 μmol/L过氧化氢，对照组加入10 μL培养液，处理4 h。
1.2.3 过氧化氢对肿瘤细胞的细胞毒性试验 取“1.2.2”项处理后的细胞按试剂盒说明书用CCK—8法检测细胞毒性试验，细胞毒死率=(A对照组—A实验组)/A对照组。
1.2.4 过氧化氢处理后的衰老检测 取“1.2.2”项下处理后的细胞按试剂盒说明书用β—半乳糖苷酶染色，37℃孵育过夜，在荧光显微镜下观察结果。拍照计数100个细胞中β—半乳糖苷酶染色阳性细胞的百分比。
1.2.5 过氧化氢处理后的活性氧检测 取“1.2.2”项下处理的细胞按试剂盒说明书进行活性氧检测，以485 nm激发波长，528 nm发射波长检测荧光强度。平均荧光强度(MFI)反应活性氧水平[2]。
1.2.6 数据处理 实验数据以x±s表示，采用SPSS 18.0统计软件进行统计分析，组间差异显著性比较采用t检验，P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 过氧化氢诱导氧化损伤的检测
结果见表1，各剂量组过氧化氢对体外培养的Hela细胞生长呈现出显著的抑制作用(P < 0.01)。过氧化氢在400 μmol/L时的细胞毒死率为47.2%，在800 μmol/L时为55.9%，在1 600 μmol/L时达89.0%，呈量效关系。
2.2 过氧化氢处理后的衰老检测
结果见表1，实验组的β—半乳糖苷酶染色阳性率细胞数明显高于空白对照组(P < 0.05或P < 0.01)，各剂量过氧化氢处理的阳性细胞率分别为32.28%、48.14%、69.47%。阳性细胞率随浓度增大而升高，呈现量效关系。
2.3 过氧化氢处理后的活性氧检测
结果见表1，各实验组过氧化氢对体外培养的Hela细胞的活性氧产生水平有明显的影响(P < 0.05或P < 0.01)。随着过氧化氢浓度的增高，肿瘤细胞产生的活性氧水平也增高，呈现量效关系。
3 讨论
本实验用过氧化氢体外处理Hela肿瘤细胞，细胞毒性试验结果显示，400 μmol/L过氧化氢的细胞毒死率为47.2%，1 600 μmol/L过氧化氢时达89.0%。细胞衰老率和活性氧产生水平也都随着过氧化氢浓度升高而增大，呈现量效关系。过氧化氢是需氧生物普遍具有的细胞氧代谢中间产物，目前的研究表明，肿瘤细胞比正常细胞对过氧化氢更为敏感，更容易由于过氧化氢含量的过高或过低而导致死亡，过氧化氢还能诱导肿瘤细胞凋亡[3—4]。过氧化氢影响肿瘤细胞增殖的作用分为两方面，一方面低浓度的过氧化氢是作为信号分子调控细胞分裂及生长，当过氧化氢的量超过某一临界值时，细胞周期会受到阻滞，甚至引发凋亡。另一方面过氧化氢可以诱导细胞产生高水平死亡活性氧，高浓度死亡活性氧可以诱导肿瘤细胞氧化损伤，引起其凋亡或坏死[5—6]。许多研究表明，肿瘤细胞谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)、SOD含量较正常细胞低。其自身能够诱导氧化应激，其活性氧水平高于正常细胞内的活性氧水平，并且对于氧化应激反应更为敏感[7—9]；这说明，肿瘤细胞对活性氧的易感性和其本身高浓度的活性氧和其抗氧化损伤防御系统缺陷等这些因素，决定了细胞在高浓度的活性氧作用下肿瘤细胞会发生凋亡，而正常细胞耐受。目前许多肿瘤治疗药物的研发也选择活性氧作为治疗靶点[10—12]。
[参考文献]
[1] 王晓琴，王振华，张波. 过氧化氢与肿瘤发生发展的关系[J]. 时珍国医国药，2011，22(7)：1576—1578.
[2] 赵朝晖，陈晓春，朱元贵，等. 三丁基过氧化氢诱导细胞衰老模型[J]. 福建医科大学学报，2003，37(1)：19—21.
[3] 孙国贵. 活性氧与肿瘤[J]. 癌变·畸变·突变，2011，23(1)：79—80.
[4] 魏燕，辛晓燕. 活性氧调控的细胞凋亡信号[J]. 现代肿瘤医学，2011，19(2)：371—373.
[5] 代晓阳，卿晨. 细胞活性氧(ROS)与肿瘤发生及干预的关系[J] ......
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