MBP不同cDNA序列真核表达载体的构建及鉴定(1)
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[摘要] 目的 以pEGFP-N1质粒载体为介导，构建针对髓鞘碱性蛋白(MBP)不同isoform cDNA的表达载体。 方法 将三段不同MBP cDNA序列克隆入pEGFP-N1质粒，转化DH5α感受态细胞，酶切鉴定及测序。 结果 测序结果显示插入的三段目的片段的序列与理论序列一致。 结论 笔者成功构建了pEGFP-N1-MBP21.5， pEGFP-N1-MBP18.5和 pEGFP-N1-MBP17.3三个重组真核表达载体，为进一步研究不同MBP cDNA在真核细胞中的表达情况和功能差异奠定基础。
[关键词] MBP cDNA；真核表达；pEGFP-N1质粒；载体构建
[中图分类号] R-33 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721(2012)12(c)-0005-03
髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein，MBP)是脊椎动物中枢神经系统少突细胞和周围神经系统雪旺细胞合成的一种膜蛋白，含有多种碱性氨基酸，为髓鞘的构成蛋白。MBP对人脑发育、神经细胞分化、髓鞘发生与髓鞘形成具有重要生理作用[1]。1962年，Laatsch RH等[2]首先从豚鼠脑中分离出MBP，随后国内外学者在生理、生化及分子水平上对MBP进行了广泛而深入的研究。人和鼠的MBP基因均位于第18号染色体远端即18q22～23，跨度32～34 Kb，含有7个外显子。人脑中有21.5，20，18.5，17.3和14 kDa等mRNA拼接产物，除21.5 kDa外，其余缺失外显子Ⅱ、Ⅲ或Ⅵ，成人髓鞘中18.5 kDa MBP含量最高[3-7]。
1 材料与方法
1.2.3 连接及转化 线性载体与目的片段序列用T4 DNA ligase，4℃连接过夜，CaCl2法制备转化大肠埃希菌感受态细胞DH5α，涂布于卡那抗性LB平板，37℃恒温培养箱培养过夜。
1.2.4 质粒筛选及鉴定 挑选克隆，提取质粒(按TaKaRa公司说明书)，HindⅢ和SalⅠ双酶切鉴定挑选阳性重组子，上海生工公司测序。
2 结果
2.1 MBP cDNA PCR扩增结果
2.3 质粒测序结果
3 讨论
3种MBP cDNA的表达在不同组织细胞和发育阶段中，具有较大差异。现阶段我们对不同MBP蛋白在神经系统的生长发育和分化过程中的具体作用和功能差异还缺乏了解。笔者将3个不同长度MBP cDNA片段插入携带绿色荧光蛋白标记基因的pEGFP-N1真核表达质粒，经酶切及测序鉴定，成功构建pEGFP-N1-MBP21.5、pEGFP-N1-MBP18.5和 pEGFP-N1-MBP17.3三个质粒载体，为进一步研究不同MBP cDNA在真核细胞中的表达情况和作用机制奠定了基础。
[参考文献]
[1] Rumsby MG. Organization and structure in central-nerve myelin[J]. Biochem Soe Trans，1978，6(2)：448-462.
[2] Laatsch RH，Thomson，J Chem，et al. The encephalomyelitic activity of myelin isolated by ultracentrifugafion[J]. J Exp Med，1962，115(4)：777-788.
[3] Kitamura K，Newman SL，Campagnoni CW，et al. Expression of a novel transcript of the myelin basic protein gene[J]. J Neurochem，1990，54(6)：2032-2041. ......
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