小剂量阿司匹林对糖尿病大鼠白细胞凋亡相关蛋白的研究(1)
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[摘要] 目的 研究小剂量阿司匹林对糖尿病大鼠白细胞凋亡相关蛋白的影响。 方法 雄性SD大鼠，尾静脉注射链脲佐菌素30 mg/kg，造成1型糖尿病动物模型，随机分为糖尿病模型组和9 mg/kg阿司匹林治疗组(ASA治疗组)，每组8只，另选8只健康雄性大鼠为正常对照组。各组大鼠灌服给药12周后，免疫组化法检测分析白细胞Caspase-3、Bax和Bcl-2的表达情况。 结果 与正常对照组比较，糖尿病模型组大鼠白细胞Caspase-3、Bax表达增强，Bcl-2的表达减弱，Bcl-2/Bax比值降低；ASA治疗组大鼠，Caspase-3、Bax表达减低，Bcl-2表达提升，并提高Bcl-2/Bax比值。 结论 小剂量阿司匹林对糖尿病大鼠白细胞凋亡相关蛋白表达有调节作用。
[关键词] 阿司匹林；糖尿病；白细胞；细胞凋亡
[中图分类号] R-33 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721(2013)02(c)-0011-03
愈来愈多的证据表明白细胞与糖尿病及其并发症关系密切。有研究表明[1-5]，糖尿病常伴有白细胞功能异常，既表现为白细胞游走和吞噬功能下降，抗感染作用减弱，增加一些机会性感染及感染后难以好转，又易表现部分白细胞活化，多种白介素和黏附因子表达异常，促进白细胞黏附和穿过血管内皮细胞，损伤血管，造成视网膜及肾脏的小血管损伤以及肢体大血管硬化。
Tennenberg SD等[6]和Glowacka E等[7]研究认为，糖尿病患者会出现中性粒细胞相关性凋亡增加，引起细胞功能性寿命下降和感染部位清除增加，这可能是糖尿病易合并感染且难好转的重要原因。 近年来，抑制白细胞凋亡已成为防治糖尿病及其并发症的重要机制[4-5]。
邱丽颖等[8-9]研究报道阿司匹林在大鼠脑缺血再灌注损伤时，通过提高Bcl-2并降低Bax基因蛋白表达，提高Bcl-2/Bax比值而发挥抗凋亡效应，从而起到神经保护作用。有研究报道阿司匹林发挥保护作用的有效剂量包括相当人常规使用的小剂量(日用100 mg)，而目前临床糖尿病患者大多因合并或并发心脑血管疾病而长期服用小剂量阿司匹林，但小剂量阿司匹林糖尿病患者长期服用，对白细胞凋亡是否有影响，进而影响白细胞功能，目前尚缺乏实验依据。本研究采用大鼠尾静脉注射链脲佐菌素造成1型糖尿病动物模型，研究相当人小剂量阿司匹林对糖尿病大鼠白细胞凋亡相关蛋白表达的影响，为小剂量阿司匹林可能会发挥改善糖尿病患者白细胞功能提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物
雄性SD大鼠30只，体重180～220 g，辽宁医学院实验动物中心提供。
1.2 主要药物、试剂和器械
拜阿司匹林(阿司匹林肠溶片)，拜耳医药保健有限公司进口分装，生产批号：BJ00557；链脲佐菌素(STZ)，美国sigma公司产品；兔抗大鼠Bcl-2抗体、Bax单克隆抗体、二步法非免疫血清、生物素二抗及辣根酶标记的链酶亲和素试剂盒(PV6001)、DAB显色试剂盒由中山杉生物技术公司提供，Caspase-3单克隆抗体、生物素化二抗试剂盒(SP0023)美国sigma购自北京博奥森公司产品；DP72型OLYMPUS 光学成像分析系统，日本奥林巴斯公司；京都Ⅱ型血糖检测仪，日本ARKRAY，Inc株式会社；TGL-168高速台式离心机，上海安亭科学仪器厂。
1.3 动物分组与处理
30只雄性SD大鼠，随机选取8只作为正常对照组，22只尾静脉注射链脲佐菌素(STZ，30 mg/kg；1 g STZ溶于100 mL柠檬酸盐缓冲液配制而成，pH=4.5)，正常对照组大鼠注射同等体积的缓冲液。3 d后，禁食12 h，剪大鼠尾尖部，采用血糖仪现场测定血糖浓度，将血糖测定结果大于16.7 mmol/L视为1型糖尿病造模成功。随机选取造模成功大鼠16只，分为糖尿病模型组和9 mg/kg阿司匹林(ASA治疗组)治疗组(按体表面积换算相当人日用100 mg)，每组8只。ASA组大鼠，拜阿司匹林片剪断研碎后加适量蒸馏水，混匀后以0.1 mL/100 g灌胃给药12周，正常对照组和糖尿病模型组大鼠同日灌服等量蒸馏水。实验结束时，大鼠禁食12 h，5%水合氯醛腹腔麻醉，剪大鼠尾尖部，采用血糖仪现场测定血糖浓度，随后心室内取血1 mL，加4 mL 0.45%冷盐水，混匀后静止15 min，低渗促红细胞溶血，1 000 r/min离心10 min，沉淀以冰生理盐水冲洗，再次1 000 r/min离心10 min，沉淀放入10%中性甲醛固定，24 h后1 000 r/min离心10 min，沉淀加1 mL 0.9%氯化钠溶液，混匀后，于防脱处理载玻片上进行细胞涂片，每只大鼠血细胞涂片10张，自然干燥后进行免疫组化染色。
1.4 血糖检测
用血糖仪及专用血糖试纸现场检测大鼠血糖。
1.5 免疫组化染色
免疫组织化学染色：将细胞涂片，高压修复抗原(将切片置于含pH=6.0枸椽酸缓冲液的高压锅内，加热至减压阀喷气2 min，自然冷却，取出，0.01 M PBS洗涤 3 次，每次 5 min)；3% 过氧化氢溶液处理10～30 min以去除内源性过氧化物酶，0.01 M PBS洗涤3 次，每次 5 min；滴加1∶100稀释的滴加第一抗体(Bcl-2、Bax)，4℃过夜，0.1 M PBS洗5 min×3次；滴加辣根酶标记羊抗兔IgG多聚体(PV6001)，37 ℃孵育 30 min，0.01 M PBS洗涤 3 次，每次 5 min；滴加生物素化第二抗体，37℃ 20 min，0.1 M PBS洗5 min，3次；滴加辣根酶标记链霉亲和素工作液 ......
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