白藜芦醇促TRAIL诱导PC—3细胞凋亡的作用(1)
[摘要] 目的 研究白藜芦醇(Res)促进肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)蛋白诱导人前列腺癌细胞PC-3凋亡的作用。 方法 实验分为TRAIL蛋白组以及联合应用白藜芦醇和TRAIL蛋白的联合用药组；采用CCK8法检测细胞增殖情况，确定白藜芦醇的用药浓度；通过CCK8法、流式细胞术检测TRAIL蛋白组、联合用药组细胞增殖和凋亡情况；分光光度法检测两组细胞caspase-8、caspase-3活性。 结果 CCK8结果提示白藜芦醇的用药浓度为50 μmol/L；联合用药组PC-3细胞的增殖率明显低于TRAIL蛋白组(P<0.05)；流式细胞术检测结果显示，联合用药组PC-3细胞的凋亡率明显高于TRAIL蛋白组(P<0.05)；caspase活性检测结果显示，联合用药组PC-3细胞caspase-8、caspase-3的活性明显高于TRAIL蛋白组(P<0.05)。 结论 白藜芦醇能够促进TRAIL蛋白诱导的PC-3细胞凋亡，为肿瘤的生物学治疗提供新的材料。
[关键词] 肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体；白藜芦醇；PC-3；凋亡
[中图分类号] R285 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721(2014)12(c)-0008-04
前列腺癌是严重威胁男性健康的肿瘤之一，发病率居世界肿瘤第六位。虽然内分泌治疗可以使大多数患者的病情得到控制和改善，但绝大多数患者会发展为激素抵抗性前列腺癌，患者生存率较低。因此，寻找有效的治疗手段延长此类患者的生存期，成为目前前列腺癌治疗的有效途径。
肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligand，TRAIL)属于肿瘤坏死因子超家族成员，能够高特异性地诱导肿瘤细胞的凋亡，且对正常组织细胞没有作用[1-4]，因而成为肿瘤生物学治疗新的热点。白藜芦醇(Resveratroi，Res)属多酚类化合物，研究发现，其不仅具有抗炎、抗动脉粥样硬化、抗氧化等作用，还可抑制乳腺癌、肝癌、肺癌等多种肿瘤细胞的生长[5-9]。本实验利用人前列腺癌细胞PC-3，观察联合应用Res和TRAIL蛋白对PC-3细胞的凋亡情况，证实Res能够促进TRAIL对PC-3细胞的凋亡作用。
1 材料与方法
1.1 材料
人前列腺癌细胞PC-3购自上海中科院细胞库；Res购自天津迈迪瑞康公司；重组人TRAIL蛋白购自TEPROTEH公司；AnnexinV/PI凋亡检测试剂盒购自天根生物公司；CCK8检测试剂盒购自碧云天公司；caspase-8、caspase-3活性检测试剂盒购自碧云天公司；其他试剂为国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 CCK8检测细胞增殖情况 将处于对数生长期的PC-3细胞以5×104/ml接种于96孔板，首先确定Res的用药浓度，分别加入Res，浓度为12.5、25、50、100 μmol/L；TRAIL蛋白组每孔加入TRAIL蛋白，浓度分别为25、50、100、200 ng/ml；联合用药组加入Res 50 μmol/L后，每孔再分别加入上述浓度TRAIL蛋白。于细胞培养箱培养24 h后，每孔分别加入CCK8试剂各10 μl，酶标仪检测OD值。以未处理的细胞作为正常组，以培养基作为空白组。细胞增殖率%=(实验组OD值-空白组OD值)/(正常组OD值-空白组OD值)×100%。
1.2.2 流式细胞术检测细胞凋亡情况 将PC-3细胞以2×105/ml接种于6孔板，培养12 h后，TRAIL蛋白组加入TRAIL蛋白100 ng/ml；联合用药组加入Res 50 μmol/L后加入TRAIL蛋白100 ng/ml，24 h后收集细胞，具体操作步骤按照AnnexinV/PI凋亡检测试剂盒说明书进行，流式细胞仪检测细胞凋亡情况。
1.2.3 caspase-8、caspase-3活性检测 将PC-3细胞以2×105/ml接种于6孔板，培养12 h后，单独应用TRAIL蛋白组加入TRAIL蛋白100 ng/ml；联合用药组加入Res 50 μmol/L后加入TRAIL蛋白100 ng/ml，12 h后收集细胞，分光光度法检测caspase-8和caspase-3活性，具体操作步骤按试剂盒说明书进行。
1.3 统计学处理
采用SPSS 16.0统计学软件进行数据分析，组间两两比较采用q检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 Res增强TRAIL蛋白对细胞增殖的抑制作用
Res组细胞CCK8实验结果显示，当Res浓度为50 μmol/L时，增殖率为(72.61±4.41)%，Res浓度为100 μmol/L时，增殖率为(70.16±3.73)%，较前差异无统计学意义(P>0.05)(表1)。TRAIL蛋白组的实验结果显示，当TRAIL蛋白的浓度为100 ng/ml时，增殖率为(69.05±6.97)%，而TRAIL蛋白浓度200 ng/ml时，PC-3细胞的增殖率为(67.72±5.68)%，较前差异无统计学意义(P>0.05)。当TRAIL蛋白浓度为100 ng/ml时，联合用药组PC-3细胞增殖率为(38.70±2.43)%，与TRAIL蛋白组相比，差异有统计学意义(P<0.05)(表2)。结果表明，Res能够明显增强TRAIL蛋白对PC-3细胞增殖的抑制作用。
2.2 Res促进TRAIL蛋白诱导的凋亡作用
2.2.1 流式细胞术检测结果 TRAIL蛋白组PC-3细胞的凋亡率为(34.86±1.25)%，联合用药组PC-3细胞的凋亡率升高至(70.55±2.90)%，差异有统计学意义(P<0.05)，说明Res可以增强TRAIL对PC-3细胞的凋亡作用(图1)。 (李小翠 尤红娟 李向阳 华慧 汤仁仙)
[关键词] 肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体；白藜芦醇；PC-3；凋亡
[中图分类号] R285 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721(2014)12(c)-0008-04
前列腺癌是严重威胁男性健康的肿瘤之一，发病率居世界肿瘤第六位。虽然内分泌治疗可以使大多数患者的病情得到控制和改善，但绝大多数患者会发展为激素抵抗性前列腺癌，患者生存率较低。因此，寻找有效的治疗手段延长此类患者的生存期，成为目前前列腺癌治疗的有效途径。
肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligand，TRAIL)属于肿瘤坏死因子超家族成员，能够高特异性地诱导肿瘤细胞的凋亡，且对正常组织细胞没有作用[1-4]，因而成为肿瘤生物学治疗新的热点。白藜芦醇(Resveratroi，Res)属多酚类化合物，研究发现，其不仅具有抗炎、抗动脉粥样硬化、抗氧化等作用，还可抑制乳腺癌、肝癌、肺癌等多种肿瘤细胞的生长[5-9]。本实验利用人前列腺癌细胞PC-3，观察联合应用Res和TRAIL蛋白对PC-3细胞的凋亡情况，证实Res能够促进TRAIL对PC-3细胞的凋亡作用。
1 材料与方法
1.1 材料
人前列腺癌细胞PC-3购自上海中科院细胞库；Res购自天津迈迪瑞康公司；重组人TRAIL蛋白购自TEPROTEH公司；AnnexinV/PI凋亡检测试剂盒购自天根生物公司；CCK8检测试剂盒购自碧云天公司；caspase-8、caspase-3活性检测试剂盒购自碧云天公司；其他试剂为国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 CCK8检测细胞增殖情况 将处于对数生长期的PC-3细胞以5×104/ml接种于96孔板，首先确定Res的用药浓度，分别加入Res，浓度为12.5、25、50、100 μmol/L；TRAIL蛋白组每孔加入TRAIL蛋白，浓度分别为25、50、100、200 ng/ml；联合用药组加入Res 50 μmol/L后，每孔再分别加入上述浓度TRAIL蛋白。于细胞培养箱培养24 h后，每孔分别加入CCK8试剂各10 μl，酶标仪检测OD值。以未处理的细胞作为正常组，以培养基作为空白组。细胞增殖率%=(实验组OD值-空白组OD值)/(正常组OD值-空白组OD值)×100%。
1.2.2 流式细胞术检测细胞凋亡情况 将PC-3细胞以2×105/ml接种于6孔板，培养12 h后，TRAIL蛋白组加入TRAIL蛋白100 ng/ml；联合用药组加入Res 50 μmol/L后加入TRAIL蛋白100 ng/ml，24 h后收集细胞，具体操作步骤按照AnnexinV/PI凋亡检测试剂盒说明书进行，流式细胞仪检测细胞凋亡情况。
1.2.3 caspase-8、caspase-3活性检测 将PC-3细胞以2×105/ml接种于6孔板，培养12 h后，单独应用TRAIL蛋白组加入TRAIL蛋白100 ng/ml；联合用药组加入Res 50 μmol/L后加入TRAIL蛋白100 ng/ml，12 h后收集细胞，分光光度法检测caspase-8和caspase-3活性，具体操作步骤按试剂盒说明书进行。
1.3 统计学处理
采用SPSS 16.0统计学软件进行数据分析，组间两两比较采用q检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 Res增强TRAIL蛋白对细胞增殖的抑制作用
Res组细胞CCK8实验结果显示，当Res浓度为50 μmol/L时，增殖率为(72.61±4.41)%，Res浓度为100 μmol/L时，增殖率为(70.16±3.73)%，较前差异无统计学意义(P>0.05)(表1)。TRAIL蛋白组的实验结果显示，当TRAIL蛋白的浓度为100 ng/ml时，增殖率为(69.05±6.97)%，而TRAIL蛋白浓度200 ng/ml时，PC-3细胞的增殖率为(67.72±5.68)%，较前差异无统计学意义(P>0.05)。当TRAIL蛋白浓度为100 ng/ml时，联合用药组PC-3细胞增殖率为(38.70±2.43)%，与TRAIL蛋白组相比，差异有统计学意义(P<0.05)(表2)。结果表明，Res能够明显增强TRAIL蛋白对PC-3细胞增殖的抑制作用。
2.2 Res促进TRAIL蛋白诱导的凋亡作用
2.2.1 流式细胞术检测结果 TRAIL蛋白组PC-3细胞的凋亡率为(34.86±1.25)%，联合用药组PC-3细胞的凋亡率升高至(70.55±2.90)%，差异有统计学意义(P<0.05)，说明Res可以增强TRAIL对PC-3细胞的凋亡作用(图1)。 (李小翠 尤红娟 李向阳 华慧 汤仁仙)