喉癌组织中Survivin、MMP—2的表达、临床意义及相关性研究(1)
[摘要] 目的 探讨喉癌组织中存活素(Survivin)和基质金属蛋白酶-2(MMP-2)的表达及其相关性。 方法 采用免疫组织化学链酶卵白素-生物素复合体(SABC)法检测Survivin、MMP-2蛋白在92例喉鳞状细胞癌及相距10 mm的癌旁组织和25例喉正常黏膜中的表达。 结果 Survivin在喉癌组织中的阳性率(76.09%)明显高于癌旁(13.04%)及喉正常黏膜组织(8.00%)，差异有统计学意义(P<0.05)，与临床分期有关，与年龄、淋巴结转移、分化程度无关。MMP-2在喉癌组织中的阳性率(78.26 %)明显高于癌旁(18.48%)及喉正常黏膜组织(12.00%)，差异有统计学意义(P<0.05)，与分化程度和临床分期有关，与年龄、淋巴结转移无关。两者呈正相关。 结论 Survivin、MMP-2的异常表达可能对喉癌的发生、发展起重要作用，联合检测可能对喉癌的早期诊断、进一步治疗和判断预后有一定参考价值。
[关键词] 喉鳞状细胞癌；存活素；基质金属蛋白酶-2；免疫组织化学
[中图分类号] R739.65 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721(2015)01(a)-0009-04
恶性肿瘤最大的特点是肿瘤细胞生长失去可调控性，且具备浸润潜能。肿瘤的侵袭和转移是恶性肿瘤的主要生物学特征，实体肿瘤的发生、发展需要充分的血管新生以提供足够的营养。研究发现，肿瘤的增殖和血管新生均受细胞凋亡的影响，存活素(Survivin)是凋亡抑制蛋白家族的一个新成员，是迄今发现最强的凋亡抑制因子[1]，恶性肿瘤发生侵袭和转移，首先必须降解细胞外基质和基底膜。基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase 2，MMP-2)是降解细胞外基质和基底膜所必需的，本实验对喉鳞癌组织中Survivin和MMP-2的表达情况进行研究，探讨其在喉鳞癌发生、发展中的作用及两者的相互关系。
1 材料与方法
1.1 标本来源
选用内蒙古医学院一附院、山西医科大学肿瘤医院2006年10月～2007年8月、包头医学院第一附属医院2008年7月～2013年12月手术治疗并病理证实的92例喉鳞癌标本及相应癌旁组织(距离癌边缘10 mm)，25例喉正常黏膜，92例喉癌组织中，男性80例，女性12例；病理分级：高分化45例，中分化30例，低分化17例；病检均为鳞状细胞癌，有淋巴结转移25例，无淋巴结转移67例；按UICC1995年分级标准：Ⅰ+Ⅱ期27例，Ⅲ+Ⅳ期65例；所有患者术前均未行放疗或化疗。
1.2 方法
手术切除的组织标本均经4%多聚甲醛固定，石蜡包埋切片、HE染色，连续切片每张厚4 μm，采用免疫组织化学链酶卵白素-生物素复合体法(SABC法)，二氨基联苯胺(DAB)显色。抗人多克隆抗体Survivin、兔抗人多克隆抗体MMP-2、SABC即用型试剂盒、DAB显色试剂均购自武汉博士德生物技术开发公司，实验步骤严格按试剂盒说明书进行，将PBS代替一抗作阴性对照，试剂公司提供阳性对照，FHIT蛋白采用正常乳腺组织，Survivin蛋白采用乳腺癌。
1.3 结果判定
显微镜下观察表达情况：在100倍视野下，观察比较不同部位的染色强度。Survivin蛋白染色阳性细胞以胞质呈黄色至棕黄色为主(图1)，偶见胞核表达[2-3]，MMP-2蛋白染色阳性细胞以胞质呈黄色至棕黄色为主(图2)。将染色强度打分：0分为无色，1分为淡黄色，2分为棕黄色，3分为棕褐色。在400倍视野下，每例随机选取不重复5个视野，计数每个视野中阳性细胞所占百分比并计分。将阳性细胞百分比打分，0分为阴性，1分为阳性细胞≤10%，2分为11%～50%，3分为51%～75%，4分为>75%。采取二次计分法[4]：染色强度与百分比的乘积>3分为免疫反应阳性。
图1 Survivin在喉癌组织中的表达
图2 MMP-2在喉癌组织中的表达
1.4 统计学处理
采用SPSS 13.0统计学软件进行数据处理，计数资料用率表示，采用χ2检验，相关关系的分析采用Spearman等级相关分析法。检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 Survivin、MMP-2在喉癌、癌旁组织及正常喉黏膜的表达
Survivin在喉癌组织中染色阳性细胞数量及强度较其癌旁组织及正常黏膜明显增多及增大，92例喉癌组织中Survivin阳性率为76.09%(70/92)，相应癌旁组织中Survivin阳性率为13.04%(12/92)，两者差异有统计学意义(P<0.05)；25例喉正常组织中Survivin表达阳性率为8.00%(2/25)，与喉癌组织比较，差异有统计学意义(P<0.05)，与癌旁组织比较，差异无统计学意义(P>0.05)。MMP-2主要表达于喉癌组织细胞胞质中，其蛋白低表达于正常喉黏膜组织中，92例喉癌组织中MMP-2阳性率为78.26%(72/92)，相应癌旁组织中MMP-2阳性率为18.48%(17/92)，两者差异有统计学意义(P<0.05)；25例喉正常组织中MMP-2表达阳性率为12.00%(3/25)，与喉癌组织比较，差异有统计学意义(P<0.05)，与癌旁组织比较，差异无统计学意义(P>0.05)(表1)。
2.2 Survivin、MMP-2表达与喉癌临床病理参数的关系
Survivin与临床分期有关(P<0.05)，与淋巴结转移、分化程度、年龄无关(P>0.05)；MMP-2与分化程度、临床分期有关(P<0.05)，与淋巴结转移、年龄无关(P>0.05)(表2)。
表2 Survivin、MMP-2与临床病理参数的关系(n) (吴春芳 李海洲 李富)
[关键词] 喉鳞状细胞癌；存活素；基质金属蛋白酶-2；免疫组织化学
[中图分类号] R739.65 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721(2015)01(a)-0009-04
恶性肿瘤最大的特点是肿瘤细胞生长失去可调控性，且具备浸润潜能。肿瘤的侵袭和转移是恶性肿瘤的主要生物学特征，实体肿瘤的发生、发展需要充分的血管新生以提供足够的营养。研究发现，肿瘤的增殖和血管新生均受细胞凋亡的影响，存活素(Survivin)是凋亡抑制蛋白家族的一个新成员，是迄今发现最强的凋亡抑制因子[1]，恶性肿瘤发生侵袭和转移，首先必须降解细胞外基质和基底膜。基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase 2，MMP-2)是降解细胞外基质和基底膜所必需的，本实验对喉鳞癌组织中Survivin和MMP-2的表达情况进行研究，探讨其在喉鳞癌发生、发展中的作用及两者的相互关系。
1 材料与方法
1.1 标本来源
选用内蒙古医学院一附院、山西医科大学肿瘤医院2006年10月～2007年8月、包头医学院第一附属医院2008年7月～2013年12月手术治疗并病理证实的92例喉鳞癌标本及相应癌旁组织(距离癌边缘10 mm)，25例喉正常黏膜，92例喉癌组织中，男性80例，女性12例；病理分级：高分化45例，中分化30例，低分化17例；病检均为鳞状细胞癌，有淋巴结转移25例，无淋巴结转移67例；按UICC1995年分级标准：Ⅰ+Ⅱ期27例，Ⅲ+Ⅳ期65例；所有患者术前均未行放疗或化疗。
1.2 方法
手术切除的组织标本均经4%多聚甲醛固定，石蜡包埋切片、HE染色，连续切片每张厚4 μm，采用免疫组织化学链酶卵白素-生物素复合体法(SABC法)，二氨基联苯胺(DAB)显色。抗人多克隆抗体Survivin、兔抗人多克隆抗体MMP-2、SABC即用型试剂盒、DAB显色试剂均购自武汉博士德生物技术开发公司，实验步骤严格按试剂盒说明书进行，将PBS代替一抗作阴性对照，试剂公司提供阳性对照，FHIT蛋白采用正常乳腺组织，Survivin蛋白采用乳腺癌。
1.3 结果判定
显微镜下观察表达情况：在100倍视野下，观察比较不同部位的染色强度。Survivin蛋白染色阳性细胞以胞质呈黄色至棕黄色为主(图1)，偶见胞核表达[2-3]，MMP-2蛋白染色阳性细胞以胞质呈黄色至棕黄色为主(图2)。将染色强度打分：0分为无色，1分为淡黄色，2分为棕黄色，3分为棕褐色。在400倍视野下，每例随机选取不重复5个视野，计数每个视野中阳性细胞所占百分比并计分。将阳性细胞百分比打分，0分为阴性，1分为阳性细胞≤10%，2分为11%～50%，3分为51%～75%，4分为>75%。采取二次计分法[4]：染色强度与百分比的乘积>3分为免疫反应阳性。
图1 Survivin在喉癌组织中的表达
图2 MMP-2在喉癌组织中的表达
1.4 统计学处理
采用SPSS 13.0统计学软件进行数据处理，计数资料用率表示，采用χ2检验，相关关系的分析采用Spearman等级相关分析法。检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 Survivin、MMP-2在喉癌、癌旁组织及正常喉黏膜的表达
Survivin在喉癌组织中染色阳性细胞数量及强度较其癌旁组织及正常黏膜明显增多及增大，92例喉癌组织中Survivin阳性率为76.09%(70/92)，相应癌旁组织中Survivin阳性率为13.04%(12/92)，两者差异有统计学意义(P<0.05)；25例喉正常组织中Survivin表达阳性率为8.00%(2/25)，与喉癌组织比较，差异有统计学意义(P<0.05)，与癌旁组织比较，差异无统计学意义(P>0.05)。MMP-2主要表达于喉癌组织细胞胞质中，其蛋白低表达于正常喉黏膜组织中，92例喉癌组织中MMP-2阳性率为78.26%(72/92)，相应癌旁组织中MMP-2阳性率为18.48%(17/92)，两者差异有统计学意义(P<0.05)；25例喉正常组织中MMP-2表达阳性率为12.00%(3/25)，与喉癌组织比较，差异有统计学意义(P<0.05)，与癌旁组织比较，差异无统计学意义(P>0.05)(表1)。
2.2 Survivin、MMP-2表达与喉癌临床病理参数的关系
Survivin与临床分期有关(P<0.05)，与淋巴结转移、分化程度、年龄无关(P>0.05)；MMP-2与分化程度、临床分期有关(P<0.05)，与淋巴结转移、年龄无关(P>0.05)(表2)。
表2 Survivin、MMP-2与临床病理参数的关系(n) (吴春芳 李海洲 李富)