OPCs移植对EAE大鼠脊髓有髓神经纤维髓鞘形态及MBP表达的影响(2)
[Key words] Multiple sclerosis；Oligodendrocyte precursor cells；Cellular transplantation；Experimental allergic encephalomyelitis
多发性硬化(multiple sclerosis，MS)是一种获得性免疫介导的慢性中枢神经系统脱髓鞘疾病[1]，临床上常表现为神经功能缺损而致畸致残，给患者的生活质量带来严重的影响，加重了社会和家庭经济负担[2]。此疾病的主要病理变化为中枢神经系统有髓神经纤维髓鞘的脱失和轴索的溃变，并且脱失的髓鞘很难自行修复，随着病程的发展，髓鞘的脱失愈加严重[3]。目前临床上常用免疫抑制剂、激素等药物进行治疗[4]，但药物治疗在疾病进展期会影响自身适应性炎症因子，使其修复固有免疫系统的作用降低，因此治疗效果欠佳[5]。根据MS的病理表现及病因，考虑输入外源性细胞进行髓鞘的修复[6]。中枢神经系统中少突胶质细胞是构成髓鞘的主要细胞，其自身不能修复。少突胶质前体细胞(oligodendrocyte precursor cells，OPCs)可定向分化为少突胶质细胞[7]，并具有较好的定向迁移能力和增殖能力[8]。在髓鞘损伤时，OPCs可对受损的髓鞘起到修复的作用，从而改善运动功能[9]。由于实验性变态反应性脑脊髓炎(experimental allergic encephalom-yelitis，EAE)模型的病程发展及组织病理学改变与MS极为相似[10]，因此本研究建立EAE大鼠模型并进行OPCs移植，观察其中枢神经系统有髓神经纤维形态及髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein，MBP)免疫组化情况，为研究MS公认的动物模型提供参考。
1 材料与方法
1.1 实验动物和分组
健康成年雄性SD大鼠30只。随机分为正常组、模型对照组、治疗组，每组10只。正常组为健康大鼠，正常饲养；模型对照组为EAE模型大鼠，造模后1周向侧脑室注射生理盐水；治疗组为造模后1周通过尾静脉移植少突胶质细胞悬液的大鼠。
1.2 主要仪器设备和试剂
倒置相差显微镜(Olympus)；OPCs(上海细胞库)；完全弗氏佐剂(Sigma)；百日咳菌素(Calbiochem)；多聚甲醛(天津福晨化学试剂厂)；DMEM培养基(Gibco)；胰蛋白酶(Gibco)；兔抗鼠MBP多克隆抗体(Sigma)；辣根酶标记的羊抗兔IgG(Sigma)；DAB试剂盒(博士德生物工程公司)。
1.3 方法
1.3.1 造模 正常大鼠戊巴比妥钠麻醉，心脏灌注冰生理盐水至右心房流出液体清亮。取出大鼠脊髓，去除脊膜和血管，称重，加等量的完全弗氏佐剂，用注射器反复抽打至形成油包水状乳化物，模型对照组和治疗组大鼠采用大鼠脊髓匀桨与完全弗氏佐剂混合做抗原单点皮下注射，剂量为0.5 ml/只。免疫后每日称重并观察大鼠运动情况[11]。
1.3.2 细胞移植 造模后10 d，消化DMEM培养基中培养且90%细胞贴壁的OPCs，并将其置于无菌离心管内，离心机离心5 min，转速为1000 r/min，重悬细胞，调整细胞浓度至1.5×105/μl，取治疗组大鼠，向尾静脉内注射2×106 OPCs悬液(约13.33 μl)，模型对照组给予同剂量生理盐水，移植后每日称重观察[12]。
1.3.3 MBP免疫组化 在OPCs移植治疗术后4周，将3组大鼠用过量麻醉剂麻醉并固定于手术台上，先用生理盐水再用4%多聚甲醛溶液快速灌注，取下脊柱剥离脊髓，将大鼠的脊髓节段放置于4%多聚甲醛溶液内固定，常规石蜡包埋，切片机切片并贴于防脱片上，二甲苯及梯度乙醇脱蜡，常规免疫组化法染色，脱水透明封片[13]。
1.4 指标评价
①记录3组大鼠不同时期体重变化。②运用BBB评分法进行运动功能评分，0分：无可见后肢运动，21分：持续性掌面移动，持续性协调步态，足趾持续抓地，活动过程中主动爪位置始终与身体平行，躯干持续稳定，尾巴持续翘起，可视为正常健康大鼠[14]。③观察各组大鼠MBP免疫组化情况。
2 结果
2.1 各组大鼠体重变化
正常组大鼠随着时间的增加体重逐渐上升，模型对照组大鼠造模后出现体重下降或不增长，治疗组大鼠造模后体重下降，细胞移植后出现短暂体重下降，后有所上升。
2.2各组大鼠运动功能变化
正常组大鼠运动功能始终处于正常水平，模型对照组大鼠造模后出现运动功能下降，治疗组大鼠造模后运动功能下降，但细胞移植后运动功能有所恢复。结果见表1。
表1 各组大鼠运动功能评分结果(分，x±s)
与正常组比较，*P<0.05；与模型对照组比较，#P<0.05
2.3 各组大鼠MBP免疫组化情况
正常组大鼠脊髓有髓神经纤维髓鞘完整。模型对照组大鼠脊髓有髓神经纤维髓鞘脱失，周围可见轴索明显肿胀，MBP阳性的髓鞘数量较少。与模型对照组比较，治疗组髓鞘缺失有所减轻，脊髓和轴索肿胀情况缓解，MBP阳性的髓鞘数量增多。见图1。
图1 各组大鼠髓鞘和轴索MBP免疫组化光镜图(纵切面，×100)
A.正常组；B.模型对照组；C.治疗组
3 讨论
MS是一种发生在中枢神经系统中的自身免疫性疾病，通过对MS患者病理改变的研究发现，病变主要累及中枢神经系统，病灶主要分布在脑和脊髓的白质中。病变初期髓鞘会发生肿胀、结构紊乱[15]，随着病程发展，病变逐渐加重，且不能自行恢复[16]，常常会导致患者出现一系列下肢运动功能障碍的症状[17]。MBP主要由少突胶质细胞合成和分泌，在脱髓鞘疾病中可用作反映髓鞘脱失情况的特异性指标[18]。本研究将OPCs移植到EAE大鼠中来观察其对缺失髓鞘的修复情况，通过对各组大鼠体重、运动功能评分及MBP免疫组化结果观察发现，正常组大鼠脊髓髓鞘染成棕黄色，颜色较深，纵切面上髓鞘大小均一，排列整齐，MBP阳性髓鞘数量较多。模型对照组大鼠脊髓髓鞘染色较浅，MBP阳性髓鞘数量较少，提示髓鞘结构被破坏。与模型对照组比较，治疗组髓鞘颜色有所加深，髓鞘结构有所恢复，MBP阳性髓鞘数量增多，脱髓鞘情况有所缓解。正常组与模型对照组比较，差异显著，提示造模效果较好。模型对照组与治疗组比较，差异显著，提示治疗效果较好。由此可见，OPCs对EAE大鼠有髓神经纤维髓鞘的修复及MBP的表达有一定的促进作用。 (张萌 张海燕 姚宏波 王月静 孙丽慧)
多发性硬化(multiple sclerosis，MS)是一种获得性免疫介导的慢性中枢神经系统脱髓鞘疾病[1]，临床上常表现为神经功能缺损而致畸致残，给患者的生活质量带来严重的影响，加重了社会和家庭经济负担[2]。此疾病的主要病理变化为中枢神经系统有髓神经纤维髓鞘的脱失和轴索的溃变，并且脱失的髓鞘很难自行修复，随着病程的发展，髓鞘的脱失愈加严重[3]。目前临床上常用免疫抑制剂、激素等药物进行治疗[4]，但药物治疗在疾病进展期会影响自身适应性炎症因子，使其修复固有免疫系统的作用降低，因此治疗效果欠佳[5]。根据MS的病理表现及病因，考虑输入外源性细胞进行髓鞘的修复[6]。中枢神经系统中少突胶质细胞是构成髓鞘的主要细胞，其自身不能修复。少突胶质前体细胞(oligodendrocyte precursor cells，OPCs)可定向分化为少突胶质细胞[7]，并具有较好的定向迁移能力和增殖能力[8]。在髓鞘损伤时，OPCs可对受损的髓鞘起到修复的作用，从而改善运动功能[9]。由于实验性变态反应性脑脊髓炎(experimental allergic encephalom-yelitis，EAE)模型的病程发展及组织病理学改变与MS极为相似[10]，因此本研究建立EAE大鼠模型并进行OPCs移植，观察其中枢神经系统有髓神经纤维形态及髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein，MBP)免疫组化情况，为研究MS公认的动物模型提供参考。
1 材料与方法
1.1 实验动物和分组
健康成年雄性SD大鼠30只。随机分为正常组、模型对照组、治疗组，每组10只。正常组为健康大鼠，正常饲养；模型对照组为EAE模型大鼠，造模后1周向侧脑室注射生理盐水；治疗组为造模后1周通过尾静脉移植少突胶质细胞悬液的大鼠。
1.2 主要仪器设备和试剂
倒置相差显微镜(Olympus)；OPCs(上海细胞库)；完全弗氏佐剂(Sigma)；百日咳菌素(Calbiochem)；多聚甲醛(天津福晨化学试剂厂)；DMEM培养基(Gibco)；胰蛋白酶(Gibco)；兔抗鼠MBP多克隆抗体(Sigma)；辣根酶标记的羊抗兔IgG(Sigma)；DAB试剂盒(博士德生物工程公司)。
1.3 方法
1.3.1 造模 正常大鼠戊巴比妥钠麻醉，心脏灌注冰生理盐水至右心房流出液体清亮。取出大鼠脊髓，去除脊膜和血管，称重，加等量的完全弗氏佐剂，用注射器反复抽打至形成油包水状乳化物，模型对照组和治疗组大鼠采用大鼠脊髓匀桨与完全弗氏佐剂混合做抗原单点皮下注射，剂量为0.5 ml/只。免疫后每日称重并观察大鼠运动情况[11]。
1.3.2 细胞移植 造模后10 d，消化DMEM培养基中培养且90%细胞贴壁的OPCs，并将其置于无菌离心管内，离心机离心5 min，转速为1000 r/min，重悬细胞，调整细胞浓度至1.5×105/μl，取治疗组大鼠，向尾静脉内注射2×106 OPCs悬液(约13.33 μl)，模型对照组给予同剂量生理盐水，移植后每日称重观察[12]。
1.3.3 MBP免疫组化 在OPCs移植治疗术后4周，将3组大鼠用过量麻醉剂麻醉并固定于手术台上，先用生理盐水再用4%多聚甲醛溶液快速灌注，取下脊柱剥离脊髓，将大鼠的脊髓节段放置于4%多聚甲醛溶液内固定，常规石蜡包埋，切片机切片并贴于防脱片上，二甲苯及梯度乙醇脱蜡，常规免疫组化法染色，脱水透明封片[13]。
1.4 指标评价
①记录3组大鼠不同时期体重变化。②运用BBB评分法进行运动功能评分，0分：无可见后肢运动，21分：持续性掌面移动，持续性协调步态，足趾持续抓地，活动过程中主动爪位置始终与身体平行，躯干持续稳定，尾巴持续翘起，可视为正常健康大鼠[14]。③观察各组大鼠MBP免疫组化情况。
2 结果
2.1 各组大鼠体重变化
正常组大鼠随着时间的增加体重逐渐上升，模型对照组大鼠造模后出现体重下降或不增长，治疗组大鼠造模后体重下降，细胞移植后出现短暂体重下降，后有所上升。
2.2各组大鼠运动功能变化
正常组大鼠运动功能始终处于正常水平，模型对照组大鼠造模后出现运动功能下降，治疗组大鼠造模后运动功能下降，但细胞移植后运动功能有所恢复。结果见表1。
表1 各组大鼠运动功能评分结果(分，x±s)
与正常组比较，*P<0.05；与模型对照组比较，#P<0.05
2.3 各组大鼠MBP免疫组化情况
正常组大鼠脊髓有髓神经纤维髓鞘完整。模型对照组大鼠脊髓有髓神经纤维髓鞘脱失，周围可见轴索明显肿胀，MBP阳性的髓鞘数量较少。与模型对照组比较，治疗组髓鞘缺失有所减轻，脊髓和轴索肿胀情况缓解，MBP阳性的髓鞘数量增多。见图1。
图1 各组大鼠髓鞘和轴索MBP免疫组化光镜图(纵切面，×100)
A.正常组；B.模型对照组；C.治疗组
3 讨论
MS是一种发生在中枢神经系统中的自身免疫性疾病，通过对MS患者病理改变的研究发现，病变主要累及中枢神经系统，病灶主要分布在脑和脊髓的白质中。病变初期髓鞘会发生肿胀、结构紊乱[15]，随着病程发展，病变逐渐加重，且不能自行恢复[16]，常常会导致患者出现一系列下肢运动功能障碍的症状[17]。MBP主要由少突胶质细胞合成和分泌，在脱髓鞘疾病中可用作反映髓鞘脱失情况的特异性指标[18]。本研究将OPCs移植到EAE大鼠中来观察其对缺失髓鞘的修复情况，通过对各组大鼠体重、运动功能评分及MBP免疫组化结果观察发现，正常组大鼠脊髓髓鞘染成棕黄色，颜色较深，纵切面上髓鞘大小均一，排列整齐，MBP阳性髓鞘数量较多。模型对照组大鼠脊髓髓鞘染色较浅，MBP阳性髓鞘数量较少，提示髓鞘结构被破坏。与模型对照组比较，治疗组髓鞘颜色有所加深，髓鞘结构有所恢复，MBP阳性髓鞘数量增多，脱髓鞘情况有所缓解。正常组与模型对照组比较，差异显著，提示造模效果较好。模型对照组与治疗组比较，差异显著，提示治疗效果较好。由此可见，OPCs对EAE大鼠有髓神经纤维髓鞘的修复及MBP的表达有一定的促进作用。 (张萌 张海燕 姚宏波 王月静 孙丽慧)