PI3K信号通路在LPS诱导RAW264.7细胞表达sTREM—1中的作用(2)
1.2 试验方法
1.2.1 试验分组 在37℃、5%CO2恒温培养箱中，常规培养小鼠巨噬细胞株RAW264.7，培养基选用DMEM培养液，每48小时更换1次。细胞铺满瓶底时传代，调整细胞密度为1×106个/ml，接种于6孔板，无血清培养基培养，72 h后随机分组培养：①LPS组：加入终浓度为100 mg/ml的LPS培养，在加入LPS后1、6、12、24、48 h等不同时间点收集细胞；②LY294002+LPS组：加入不同终浓度为5、10、20 μmol/L的LY294002液预处理细胞1 h后，加入100 mg/ml LPS刺激1 h后收集细胞。
1.2.2 PI3K蛋白表达检测 采用Western blot法检测PI3K蛋白表达，收集细胞，经PBS洗涤2次，加入裂解液充分裂解，裂解产物12 000 r/min离心20 min，收集上清。使用二辛可酸法(bicinchoninic acid，BCA)测定总蛋白量。每份样品取50 μg蛋白，加入SDS-Loading Buffer混匀，经SDS-聚丙烯酰胺凝胶垂直凝胶电泳300 mA电转移至聚偏二氟乙烯膜。5%脱脂奶粉室温封2 h，TBS洗膜后分别加PI3K抗体4℃孵育过夜，1∶2500辣根过氧化物酶-羊抗兔IgG单克隆抗体作为二抗孵育PVDF膜，室温孵育2 h，免疫印迹化学发光(ECL)试剂曝光。用抗体剥脱液剥脱抗体后，按同样的方法与抗β-actin抗体孵育。Quantity One软件分析蛋白条带。目的蛋白定量采用灰度比值PI3K/β-actin计算。PI3K相对表达量= PI3K Ct值倒数/GADPH Ct值倒数。
1.2.3 PI3K mRNA检测 采用RT-PCR法检测PI3K mRNA的表达，PI3K的基因引物序列由Primer 5.0软件自行设计，上游序列：5′-CC AAG AGC GGT ACA GCA AAG AAT-3′，下游序列：5′-TC GCC GTC CAC CAC TAC AGA-3′，扩增产物长度500 bp。内参β-actin的上游引物序列为：5′-GC CTC GCT GTC CAC CTT CCA-3′，下游引物序列为：5′-CA CCT TCA CCG TTC CAG TTT-3′，扩增产物长度为259 bp。收集细胞后用Trizol试剂提取细胞总RNA；按逆转录试剂盒说明书逆转录合成cDNA，再利用引物对目的基因进行扩增，扩增后产物于1.5%的琼脂糖凝胶中电泳，电泳结束后在凝胶成像系统中进行分析，对各条带的积分光密度进行测定，然后同内参β-actin的光密度积分值进行对比，得出PI3K mRNA表达的相对水平。
1.2.4 sTREM-1表达的影响 用ELISA法检测细胞培养上清液中sTREM-1含量，具体操作遵照说明书进行。
1.3 统计学方法
采用SPSS 13.0统计学软件分析处理，计量资料数据采用均数±标准差(x±s)表示，采用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 LPS对PI3K蛋白表达的影响
100 mg/ml LPS作用1、6、12、24 h后，PI3K蛋白表达不断增高，24～48 h PI3K蛋白表达降低(图1)。
图1 LPS对PI3K蛋白表达的影响
2.2 LPS对PI3K mRNA表达的影响
100 mg/ml LPS作用1、6、12、24 h后，PI3K mRNA表达不断增高，24～48 h PI3K mRNA表达降低(图2)。
图2 LPS对PI3K mRNA表达的影响
2.3 LY294002对PI3K mRNA表达的影响
LY294002可抑制PI3K mRNA表达，随着LY294002浓度的增高，抑制作用更加明显，呈浓度依赖性(图3)。
图3 LY294002对PI3K mRNA表达的影响
2.4 LPS对sTREM-1表达水平的影响
随着LPS(100 mg/ml)作用时间的延长，sTREM-1表达水平呈时间依赖性上升(图4)。
图4 LPS对sTREM-1表达水平的影响
2.5 LY294002对sTREM-1表达的影响
LY294002可抑制sTREM-1表达，随着LY294002浓度的增高，抑制作用更加明显，呈浓度依赖性(图5)。
图5 LY294002对sTREM-1表达的影响
与0 μmol/L比较，*P<0.05，**P<0.01
3 讨论
脓毒症的发病机制非常复杂。研究表明，感染致使机体炎症细胞活化并产生多种促炎因子[5-6]，这些因子又可引起更多炎症细胞的激活，两者互为因果，形成炎症级联反应，并且这种级联反应逐级放大，最终导致脓毒症的发生和发展。因此，适时合理地干预炎性反应的始动环节，是治疗脓毒症的重要目标。
sTREM-1可选择性地表达在中性粒细胞和成熟单核、巨噬细胞上，能诱导这些细胞分泌TNF-α、IL-1β、干扰素γ等促炎细胞因子[6-7]；sTREM-1还可进一步作用于炎性反应，促进炎症因子的释放，还可正反馈促进TREM-1表达的上调，从而引起炎性反应的增强、放大，导致过度的炎性反应[8-9]，因此，sTREM-1作为一种重要的促炎症细胞因子，是导致脓毒症发生发展的关键启动因子，但是关于脓毒症时调控TREM-1表达的机制尚未完全阐明。
PI3K家族是一类同时具有脂质与蛋白激酶活性的，可特异性催化磷脂酰肌醇及其衍生物肌醇环3-位羟基磷酸化，产生具有第二信使作用的肌醇脂物质的激酶，PI3K是许多细胞活动、分子信号转导的关键通路[10-12]，多种刺激均可导致PI3K活化，通过影响基因的转录和调控，调节细胞的生物学行为。 (冯清州 杜娟 高伟良 刘晅)
1.2.1 试验分组 在37℃、5%CO2恒温培养箱中，常规培养小鼠巨噬细胞株RAW264.7，培养基选用DMEM培养液，每48小时更换1次。细胞铺满瓶底时传代，调整细胞密度为1×106个/ml，接种于6孔板，无血清培养基培养，72 h后随机分组培养：①LPS组：加入终浓度为100 mg/ml的LPS培养，在加入LPS后1、6、12、24、48 h等不同时间点收集细胞；②LY294002+LPS组：加入不同终浓度为5、10、20 μmol/L的LY294002液预处理细胞1 h后，加入100 mg/ml LPS刺激1 h后收集细胞。
1.2.2 PI3K蛋白表达检测 采用Western blot法检测PI3K蛋白表达，收集细胞，经PBS洗涤2次，加入裂解液充分裂解，裂解产物12 000 r/min离心20 min，收集上清。使用二辛可酸法(bicinchoninic acid，BCA)测定总蛋白量。每份样品取50 μg蛋白，加入SDS-Loading Buffer混匀，经SDS-聚丙烯酰胺凝胶垂直凝胶电泳300 mA电转移至聚偏二氟乙烯膜。5%脱脂奶粉室温封2 h，TBS洗膜后分别加PI3K抗体4℃孵育过夜，1∶2500辣根过氧化物酶-羊抗兔IgG单克隆抗体作为二抗孵育PVDF膜，室温孵育2 h，免疫印迹化学发光(ECL)试剂曝光。用抗体剥脱液剥脱抗体后，按同样的方法与抗β-actin抗体孵育。Quantity One软件分析蛋白条带。目的蛋白定量采用灰度比值PI3K/β-actin计算。PI3K相对表达量= PI3K Ct值倒数/GADPH Ct值倒数。
1.2.3 PI3K mRNA检测 采用RT-PCR法检测PI3K mRNA的表达，PI3K的基因引物序列由Primer 5.0软件自行设计，上游序列：5′-CC AAG AGC GGT ACA GCA AAG AAT-3′，下游序列：5′-TC GCC GTC CAC CAC TAC AGA-3′，扩增产物长度500 bp。内参β-actin的上游引物序列为：5′-GC CTC GCT GTC CAC CTT CCA-3′，下游引物序列为：5′-CA CCT TCA CCG TTC CAG TTT-3′，扩增产物长度为259 bp。收集细胞后用Trizol试剂提取细胞总RNA；按逆转录试剂盒说明书逆转录合成cDNA，再利用引物对目的基因进行扩增，扩增后产物于1.5%的琼脂糖凝胶中电泳，电泳结束后在凝胶成像系统中进行分析，对各条带的积分光密度进行测定，然后同内参β-actin的光密度积分值进行对比，得出PI3K mRNA表达的相对水平。
1.2.4 sTREM-1表达的影响 用ELISA法检测细胞培养上清液中sTREM-1含量，具体操作遵照说明书进行。
1.3 统计学方法
采用SPSS 13.0统计学软件分析处理，计量资料数据采用均数±标准差(x±s)表示，采用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 LPS对PI3K蛋白表达的影响
100 mg/ml LPS作用1、6、12、24 h后，PI3K蛋白表达不断增高，24～48 h PI3K蛋白表达降低(图1)。
图1 LPS对PI3K蛋白表达的影响
2.2 LPS对PI3K mRNA表达的影响
100 mg/ml LPS作用1、6、12、24 h后，PI3K mRNA表达不断增高，24～48 h PI3K mRNA表达降低(图2)。
图2 LPS对PI3K mRNA表达的影响
2.3 LY294002对PI3K mRNA表达的影响
LY294002可抑制PI3K mRNA表达，随着LY294002浓度的增高，抑制作用更加明显，呈浓度依赖性(图3)。
图3 LY294002对PI3K mRNA表达的影响
2.4 LPS对sTREM-1表达水平的影响
随着LPS(100 mg/ml)作用时间的延长，sTREM-1表达水平呈时间依赖性上升(图4)。
图4 LPS对sTREM-1表达水平的影响
2.5 LY294002对sTREM-1表达的影响
LY294002可抑制sTREM-1表达，随着LY294002浓度的增高，抑制作用更加明显，呈浓度依赖性(图5)。
图5 LY294002对sTREM-1表达的影响
与0 μmol/L比较，*P<0.05，**P<0.01
3 讨论
脓毒症的发病机制非常复杂。研究表明，感染致使机体炎症细胞活化并产生多种促炎因子[5-6]，这些因子又可引起更多炎症细胞的激活，两者互为因果，形成炎症级联反应，并且这种级联反应逐级放大，最终导致脓毒症的发生和发展。因此，适时合理地干预炎性反应的始动环节，是治疗脓毒症的重要目标。
sTREM-1可选择性地表达在中性粒细胞和成熟单核、巨噬细胞上，能诱导这些细胞分泌TNF-α、IL-1β、干扰素γ等促炎细胞因子[6-7]；sTREM-1还可进一步作用于炎性反应，促进炎症因子的释放，还可正反馈促进TREM-1表达的上调，从而引起炎性反应的增强、放大，导致过度的炎性反应[8-9]，因此，sTREM-1作为一种重要的促炎症细胞因子，是导致脓毒症发生发展的关键启动因子，但是关于脓毒症时调控TREM-1表达的机制尚未完全阐明。
PI3K家族是一类同时具有脂质与蛋白激酶活性的，可特异性催化磷脂酰肌醇及其衍生物肌醇环3-位羟基磷酸化，产生具有第二信使作用的肌醇脂物质的激酶，PI3K是许多细胞活动、分子信号转导的关键通路[10-12]，多种刺激均可导致PI3K活化，通过影响基因的转录和调控，调节细胞的生物学行为。 (冯清州 杜娟 高伟良 刘晅)