免疫组化指标在乳腺癌组织中的表达及其应用价值(2)
1.2 试剂与方法
免疫组化染色一抗Ki67、VEGF、P53与C-erbB-2工作液。将所有纳入研究组织标本均给予甲醛液固定1 d，作石蜡包埋，连续切片，贴于含APES的载玻片上，在60℃条件下烘烤2 h。随后作免疫组化染色。常规石蜡切片后脱蜡，在浓度为3%的双氧水室温下孵育10 min左右，清除过氧化物酶活性，行蒸馏水冲洗，PBS洗涤，浸泡，时间为5 min。后作抗原修复，血清封闭，在室温条件下孵育10 min，弃血清，加入四种一抗工作液，在37℃温度环境下孵育2 h，作PBS洗涤，重复3次，5 min/次，滴入二抗，加入辣根酶标记物，孵育0.5 h后，作PBS洗涤，重复3次。作DAB显色处理，随后采用清水冲洗，复染，最后作封面处理。并将阳性标本作为对照标准，以PBS作为阴性对照。每张切片均至少取3个高倍视野，观察细胞颜色及比例。
1.3 阳性结果判定标准
①Ki67细胞阳性：细胞多数呈棕黄色，核着色表现，少数呈弱细胞质染色；p53细胞阳性：呈棕黄色、核着色表现，少部分呈现较弱细胞质染色表现；VEGF阳性：胞浆着色；阴性：不着色。阴性(-)：阳性细胞数低于10%。②Ki67、p53及VEGF阳性程度标准：弱阳性(+)：阳性细胞数10%～25%；阳性(++)：阳性细胞数>25%～50%；强阳性(+++)：阳性细胞数超过50%。③C-erbB-2阳性：膜着色，着色细胞数超过10%。阴性：不着色；弱阳性：着色弱，不连续；阳性：着色中等，部分不连续；强阳性：着色强，且呈连续性表现。
1.4 统计学方法
采用SPSS 19.0统计学软件处理数据。计数资料以率表示，采用χ2检验。等级资料用非参数秩和检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 Ki67、VEGF、p53与C-erbB-2在乳腺癌组织中的表达情况
Ki67在乳腺癌组织中表达阳性率最高，为75.71%，其次为C-erbB-2，为67.14%(表1)。
2.2 Ki67、VEGF、p53与C-erbB-2的表达与病理因素的关系
乳腺癌组织Ki67表达水平与乳腺癌患者年龄、肿瘤直径无明显联系，但与乳腺癌患者肿瘤分期有显著相关性，癌症分期越高，乳腺组织Ki67阳性率越高，C-erbB-2表达阳性率与乳腺癌患者年龄有相关性，年龄越轻，乳腺C-erbB-2阳性率越高，p53与VEGF阳性率与患者年龄、肿瘤直径、肿瘤分期均未体现明显相关性(表2)。
3 讨论
Ki67核抗原在细胞增殖中的表达作用最早由国外学者提出，当前已被临床上认定为核增殖的特异性标志物，主要存在于人体细胞周期中除G0期外的不同阶段，最初表达于G1期，在G2期与S期增殖明显，到M期则达到峰值[5-6]。且于细胞分裂晚期消失，其半衰期相对较短，在脱离细胞周期后可快速降解，因此可将其作为测定肿瘤细胞增殖活性的重要标志[7]。当前临床上已有大量研究报道均证实，Ki67可反馈乳腺癌患者肿瘤增殖率，可将其作为评估肿瘤进展、转移及患者预后水平的重要标志[8-9]。
本组研究结果证实，所有乳腺癌患者乳腺组织中Ki67表达阳性率达到75.71%，与早期研究学者报道的77.9%较为相近[10]。同时本组研究证实，患者乳腺组织Ki67表达水平同样与乳腺癌临床分期存在一定的相关性，晚期肿瘤患者阳性率明显高于早中期患者，提示乳腺组织Ki67水平与癌症组织的生长与浸润存在关联[11]。当前国内外尚无较多报道对Ki67表达与乳腺癌分期进行研究，仅有部分文献提示可将Ki67指标作为评估乳腺癌患者化疗敏感性的重要标志[12]。同时本组研究证实，患者乳腺组织Ki67表达水平与其是否存在淋巴结转移无明显相关性，与早期研究报道意见尚未统一，有待下一步探究。
当前也有部分研究报道提示，肿瘤的生长、浸润、转移同样与新生血管的形成存在一定的相关性[13]。而VEGF属于调控血管生成的关键因子，可作用于血管内皮细胞，在细胞有丝分裂中起到重要的作用，可增加毛细血管通透性，进而达到促进肿瘤生长的目的[14]。且有报道证实，VEGF与Ki67在乳腺肿瘤的进展过程中有显著的协同作用，癌症细胞增殖活性提升，同样可促进新生血管的形成[15]。而本组研究结果证实，乳腺组织中VEGF与Ki67的共同表达与患者肿瘤直径、癌症分期有明显的相关性，因此认为恶性肿瘤的进展与肿瘤细胞的增殖活性及新生血管等不同的生物学因素相关。而p53位于17号染色体短臂上，其中野生型p53基因可限制细胞转化，抑制癌细胞活动，突变型p53基因则可引起细胞的癌变及转化，促进癌细胞无限增生，是引起乳腺癌患者病情进展及恶化的相关因子。有研究者表示，超过50%的肿瘤均存在p53基因突变表现，而统计显示乳腺癌患者p53蛋白阳性率在20%～60%，本组p53阳性率为62.86%，稍高于早期报道，且其与Ki67的表达呈正相关，提示两者均在乳腺癌肿瘤生长过程中发挥重要的调节与协同作用。此外，p53基因突变在一定程度上可调节促进血管增生的内皮生长因子，调控肿瘤血管生长。且p53表达阳性的肿瘤其侵袭性高，需引起重视。C-erbB-2则为来源于细胞的癌基因，一般情况下处于未激活状态，参与细胞的分化与生长调节构成，具备肿瘤转化活性。当前已公认其为与乳腺癌发生与进展相关密切的肿瘤基因。其过度表达通常提示乳腺癌肿瘤程度高，患者预后水平差。本组结果证实，乳腺癌患者C-erbB-2表达水平与患者年龄呈明显相关性，年龄越轻，其乳腺癌阳性表达率越高。进一步证实，肿瘤的发生与进展与多种基因变异及协同作用相关。
综上，乳腺癌患者乳腺组织中Ki67表达的阳性率与癌症分期呈正相关，C-erbB-2的表达水平与患者年龄有密切联系，且Ki67阳性表达与C-erbB-2及p53表达呈正相关，可将Ki67指标作为评估乳腺癌患者病情进展的重要标志。 (王开昕 刘少雄 张金芳等)
免疫组化染色一抗Ki67、VEGF、P53与C-erbB-2工作液。将所有纳入研究组织标本均给予甲醛液固定1 d，作石蜡包埋，连续切片，贴于含APES的载玻片上，在60℃条件下烘烤2 h。随后作免疫组化染色。常规石蜡切片后脱蜡，在浓度为3%的双氧水室温下孵育10 min左右，清除过氧化物酶活性，行蒸馏水冲洗，PBS洗涤，浸泡，时间为5 min。后作抗原修复，血清封闭，在室温条件下孵育10 min，弃血清，加入四种一抗工作液，在37℃温度环境下孵育2 h，作PBS洗涤，重复3次，5 min/次，滴入二抗，加入辣根酶标记物，孵育0.5 h后，作PBS洗涤，重复3次。作DAB显色处理，随后采用清水冲洗，复染，最后作封面处理。并将阳性标本作为对照标准，以PBS作为阴性对照。每张切片均至少取3个高倍视野，观察细胞颜色及比例。
1.3 阳性结果判定标准
①Ki67细胞阳性：细胞多数呈棕黄色，核着色表现，少数呈弱细胞质染色；p53细胞阳性：呈棕黄色、核着色表现，少部分呈现较弱细胞质染色表现；VEGF阳性：胞浆着色；阴性：不着色。阴性(-)：阳性细胞数低于10%。②Ki67、p53及VEGF阳性程度标准：弱阳性(+)：阳性细胞数10%～25%；阳性(++)：阳性细胞数>25%～50%；强阳性(+++)：阳性细胞数超过50%。③C-erbB-2阳性：膜着色，着色细胞数超过10%。阴性：不着色；弱阳性：着色弱，不连续；阳性：着色中等，部分不连续；强阳性：着色强，且呈连续性表现。
1.4 统计学方法
采用SPSS 19.0统计学软件处理数据。计数资料以率表示，采用χ2检验。等级资料用非参数秩和检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 Ki67、VEGF、p53与C-erbB-2在乳腺癌组织中的表达情况
Ki67在乳腺癌组织中表达阳性率最高，为75.71%，其次为C-erbB-2，为67.14%(表1)。
2.2 Ki67、VEGF、p53与C-erbB-2的表达与病理因素的关系
乳腺癌组织Ki67表达水平与乳腺癌患者年龄、肿瘤直径无明显联系，但与乳腺癌患者肿瘤分期有显著相关性，癌症分期越高，乳腺组织Ki67阳性率越高，C-erbB-2表达阳性率与乳腺癌患者年龄有相关性，年龄越轻，乳腺C-erbB-2阳性率越高，p53与VEGF阳性率与患者年龄、肿瘤直径、肿瘤分期均未体现明显相关性(表2)。
3 讨论
Ki67核抗原在细胞增殖中的表达作用最早由国外学者提出，当前已被临床上认定为核增殖的特异性标志物，主要存在于人体细胞周期中除G0期外的不同阶段，最初表达于G1期，在G2期与S期增殖明显，到M期则达到峰值[5-6]。且于细胞分裂晚期消失，其半衰期相对较短，在脱离细胞周期后可快速降解，因此可将其作为测定肿瘤细胞增殖活性的重要标志[7]。当前临床上已有大量研究报道均证实，Ki67可反馈乳腺癌患者肿瘤增殖率，可将其作为评估肿瘤进展、转移及患者预后水平的重要标志[8-9]。
本组研究结果证实，所有乳腺癌患者乳腺组织中Ki67表达阳性率达到75.71%，与早期研究学者报道的77.9%较为相近[10]。同时本组研究证实，患者乳腺组织Ki67表达水平同样与乳腺癌临床分期存在一定的相关性，晚期肿瘤患者阳性率明显高于早中期患者，提示乳腺组织Ki67水平与癌症组织的生长与浸润存在关联[11]。当前国内外尚无较多报道对Ki67表达与乳腺癌分期进行研究，仅有部分文献提示可将Ki67指标作为评估乳腺癌患者化疗敏感性的重要标志[12]。同时本组研究证实，患者乳腺组织Ki67表达水平与其是否存在淋巴结转移无明显相关性，与早期研究报道意见尚未统一，有待下一步探究。
当前也有部分研究报道提示，肿瘤的生长、浸润、转移同样与新生血管的形成存在一定的相关性[13]。而VEGF属于调控血管生成的关键因子，可作用于血管内皮细胞，在细胞有丝分裂中起到重要的作用，可增加毛细血管通透性，进而达到促进肿瘤生长的目的[14]。且有报道证实，VEGF与Ki67在乳腺肿瘤的进展过程中有显著的协同作用，癌症细胞增殖活性提升，同样可促进新生血管的形成[15]。而本组研究结果证实，乳腺组织中VEGF与Ki67的共同表达与患者肿瘤直径、癌症分期有明显的相关性，因此认为恶性肿瘤的进展与肿瘤细胞的增殖活性及新生血管等不同的生物学因素相关。而p53位于17号染色体短臂上，其中野生型p53基因可限制细胞转化，抑制癌细胞活动，突变型p53基因则可引起细胞的癌变及转化，促进癌细胞无限增生，是引起乳腺癌患者病情进展及恶化的相关因子。有研究者表示，超过50%的肿瘤均存在p53基因突变表现，而统计显示乳腺癌患者p53蛋白阳性率在20%～60%，本组p53阳性率为62.86%，稍高于早期报道，且其与Ki67的表达呈正相关，提示两者均在乳腺癌肿瘤生长过程中发挥重要的调节与协同作用。此外，p53基因突变在一定程度上可调节促进血管增生的内皮生长因子，调控肿瘤血管生长。且p53表达阳性的肿瘤其侵袭性高，需引起重视。C-erbB-2则为来源于细胞的癌基因，一般情况下处于未激活状态，参与细胞的分化与生长调节构成，具备肿瘤转化活性。当前已公认其为与乳腺癌发生与进展相关密切的肿瘤基因。其过度表达通常提示乳腺癌肿瘤程度高，患者预后水平差。本组结果证实，乳腺癌患者C-erbB-2表达水平与患者年龄呈明显相关性，年龄越轻，其乳腺癌阳性表达率越高。进一步证实，肿瘤的发生与进展与多种基因变异及协同作用相关。
综上，乳腺癌患者乳腺组织中Ki67表达的阳性率与癌症分期呈正相关，C-erbB-2的表达水平与患者年龄有密切联系，且Ki67阳性表达与C-erbB-2及p53表达呈正相关，可将Ki67指标作为评估乳腺癌患者病情进展的重要标志。 (王开昕 刘少雄 张金芳等)