MMP—9与TIMP—1在复发性流产中的基因表达及相关性研究(1)
[摘要] 目的 检测MMP-9、TIMP-1在复发性流产绒毛组织中的mRNA相对表达量，研究MMP-9和TIMP-1的表达失衡与复发性流产的相关性。 方法 选取2013年4～12月我院妇科门诊正常早孕和复发性流产妇女的绒毛组织各19例和28例，RT-PCR检测MMP-9、TIMP-1的相对表达量。 结果 复发性流产组绒毛MMP-9 mRNA的相对表达量为4.11±0.42，正常早孕组绒毛MMP-9 mRNA的相对表达量为2.45±0.36，两组比较差异有统计学意义(P<0.01)；复发性流产组绒毛TIMP-1 mRNA相对表达量为7.62±1.54，正常早孕组绒毛TIMP-1相对表达量为8.41±1.02，两组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。 结论 复发性流产绒毛组织中的MMP-9 mRNA表达量显著下降，TIMP-1 mRNA表达量升高，MMP-9和TIMP-1的表达失衡参与了复发性流产的发生、发展。
[关键词] 复发性流产；MMP-9；TIMP-1
[中图分类号] R714.21 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721(2015)08(a)-0093-04
自然流产连续发生≥2次称为复发性流产，复发性流产临床较常见，近年来其发病有上升趋势，严重影响患者的身心健康，影响家庭幸福和社会健康发展，因此探求复发性流产的发病机制，为临床治疗和预防复发性流产提供科学依据有重要意义。本研究采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测不明原因复发性流产和正常早孕绒毛组织中MMP-9及TIMP-1 mRNA相对表达量，通过比较两组MMP-9和TIMP-1的基因表达水平，探讨MMP-9和TIMP-1动态失衡与复发性流产发生、发展的关系，从分子水平研究复发性流产的发生、发展机制。
1 资料与方法
1.1 一般资料
研究对象为2013年4～12月在我院妇科门诊就诊患者，年龄18～35岁，月经周期5～7/28～30 d，停经45～60 d，经临床妇科检查、β-HCG和孕酮、彩超证实为宫内妊娠，自愿选择人工流产的宫内妊娠活胎19例和复发性流产28例(自然流产≥2次，各项检查提示胚胎停育)。流产前两组病史、年龄、孕产次、停经天数均无明显差异。
1.2标本采集
1.2.1 正常早孕组19例 彩超提示：宫内单活胚。常规负压吸宫术选取吸出物中的绒毛组织，液氮冻存。
1.2.2 复发性流产组28例 彩超提示：宫内妊娠未见胎心，结合β-HCG和孕酮，确诊为胚胎停育，行负压吸宫术，留取绒毛组织液氮冻存。
1.3 研究方法
1.3.1 试剂 DNA Extraction kit (BioFlux)，Taq polymerase(BioCer)，Realtime PCR Master Mix(BioCer)，Probe GAPDH(BioRad)，Probe MMP9和TIMP1(BioRD)均购于深圳市中生生物技术公司。
1.3.2 组织总RNA提取 ①取10～30 mg组织块，放入6 mm陶瓷研钵中，加入液氮，剪成1 mm见方小块，用陶瓷研磨杵充分研磨，直至成粉；②将研磨好的粉末迅速转入1.5 ml离心管中，离心管中预先加入 600 μl Trizol溶液，充分颠倒混匀，室温静置5 min；③转移上清液至吸附柱中，吸附柱套上新的离心管，12 000 r/min，离心30 s；④弃去外套管中液体，向吸附柱中加入600 μl洗脱液，12 000 r/min，离心30 s；⑤重复步骤④一次；⑥弃去管中液体，空柱12 000 r/min，离心1 min；⑦将吸附柱转移到新的离心管，加入20 μl洗脱液，12 000 r/min，离心30 s。管中液体即为提取的总RNA溶液，立即用于下游实验或-80℃冻存。
1.3.3 目的基因和内参基因引物序列及产物特征 见表1、图1。
图1显示部分目的基因扩增曲线的情况，横坐标表示PCR循环数，纵坐标表示基因表达量的荧光度，基因扩增曲线与横线的交汇点表示CT值，目的基因表达浓度越高，CT值越小。A：TIMP-1基因扩增曲线；B：MMP-9基因扩增曲线
图1 目的基因扩增曲线图
1.4 统计学分析
采用SPSS 17.0统计软件对数据进行分析，计量资料以x±s表示，采用t检验，计数资料用百分率(%)表示，采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 两组MMP-9、TIMP-1基因平均CT值的比较
现在常用的两种分析实时定量PCR实验数据的方法是绝对定量和相对定量。绝对定量通过标准曲线计算起始模板的拷贝数；相对定量方法是比较经过处理的样品和未经处理的样品目标转录本之间的表达差异。2-ΔΔCT方法是实时定量PCR实验中分析基因表达相对变化的一种简便方法，即相对定量的一种简便方法。MMP-9平均CT值的差值=6.87-3.51=3.36， 2-ΔΔCT=0.097，即复发性流产组绒毛MMP-9 mRNA表达量相当于正常早孕组的0.097倍；TIMP-1平均CT值的差值=8.74-12.14=-3.398，2-ΔΔCT=10.54，即复发性流产组绒毛TIMP-1 mRNA表达量相当于正常早孕组的10.54倍(表2)。
2.2 两组mRNA相对表达量的比较
复发性流产组绒毛MMP-9 mRNA的平均表达量为4.11±0.42，相当于正常组绒毛的0.097倍(2-ΔΔCT=0.097，表2)，较正常早孕组表达明显下降，差异有统计学意义(P<0.01)；复发性流产组绒毛TIMP-1平均表达量为7.62±1.54，相当于正常早孕组绒毛的10.542倍(2-ΔΔCT=10.54，表2)，较正常早孕组表达升高，差异无统计学意义(P=0.65)(表3)。 (蒋德菊等)
[关键词] 复发性流产；MMP-9；TIMP-1
[中图分类号] R714.21 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721(2015)08(a)-0093-04
自然流产连续发生≥2次称为复发性流产，复发性流产临床较常见，近年来其发病有上升趋势，严重影响患者的身心健康，影响家庭幸福和社会健康发展，因此探求复发性流产的发病机制，为临床治疗和预防复发性流产提供科学依据有重要意义。本研究采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测不明原因复发性流产和正常早孕绒毛组织中MMP-9及TIMP-1 mRNA相对表达量，通过比较两组MMP-9和TIMP-1的基因表达水平，探讨MMP-9和TIMP-1动态失衡与复发性流产发生、发展的关系，从分子水平研究复发性流产的发生、发展机制。
1 资料与方法
1.1 一般资料
研究对象为2013年4～12月在我院妇科门诊就诊患者，年龄18～35岁，月经周期5～7/28～30 d，停经45～60 d，经临床妇科检查、β-HCG和孕酮、彩超证实为宫内妊娠，自愿选择人工流产的宫内妊娠活胎19例和复发性流产28例(自然流产≥2次，各项检查提示胚胎停育)。流产前两组病史、年龄、孕产次、停经天数均无明显差异。
1.2标本采集
1.2.1 正常早孕组19例 彩超提示：宫内单活胚。常规负压吸宫术选取吸出物中的绒毛组织，液氮冻存。
1.2.2 复发性流产组28例 彩超提示：宫内妊娠未见胎心，结合β-HCG和孕酮，确诊为胚胎停育，行负压吸宫术，留取绒毛组织液氮冻存。
1.3 研究方法
1.3.1 试剂 DNA Extraction kit (BioFlux)，Taq polymerase(BioCer)，Realtime PCR Master Mix(BioCer)，Probe GAPDH(BioRad)，Probe MMP9和TIMP1(BioRD)均购于深圳市中生生物技术公司。
1.3.2 组织总RNA提取 ①取10～30 mg组织块，放入6 mm陶瓷研钵中，加入液氮，剪成1 mm见方小块，用陶瓷研磨杵充分研磨，直至成粉；②将研磨好的粉末迅速转入1.5 ml离心管中，离心管中预先加入 600 μl Trizol溶液，充分颠倒混匀，室温静置5 min；③转移上清液至吸附柱中，吸附柱套上新的离心管，12 000 r/min，离心30 s；④弃去外套管中液体，向吸附柱中加入600 μl洗脱液，12 000 r/min，离心30 s；⑤重复步骤④一次；⑥弃去管中液体，空柱12 000 r/min，离心1 min；⑦将吸附柱转移到新的离心管，加入20 μl洗脱液，12 000 r/min，离心30 s。管中液体即为提取的总RNA溶液，立即用于下游实验或-80℃冻存。
1.3.3 目的基因和内参基因引物序列及产物特征 见表1、图1。
图1显示部分目的基因扩增曲线的情况，横坐标表示PCR循环数，纵坐标表示基因表达量的荧光度，基因扩增曲线与横线的交汇点表示CT值，目的基因表达浓度越高，CT值越小。A：TIMP-1基因扩增曲线；B：MMP-9基因扩增曲线
图1 目的基因扩增曲线图
1.4 统计学分析
采用SPSS 17.0统计软件对数据进行分析，计量资料以x±s表示，采用t检验，计数资料用百分率(%)表示，采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 两组MMP-9、TIMP-1基因平均CT值的比较
现在常用的两种分析实时定量PCR实验数据的方法是绝对定量和相对定量。绝对定量通过标准曲线计算起始模板的拷贝数；相对定量方法是比较经过处理的样品和未经处理的样品目标转录本之间的表达差异。2-ΔΔCT方法是实时定量PCR实验中分析基因表达相对变化的一种简便方法，即相对定量的一种简便方法。MMP-9平均CT值的差值=6.87-3.51=3.36， 2-ΔΔCT=0.097，即复发性流产组绒毛MMP-9 mRNA表达量相当于正常早孕组的0.097倍；TIMP-1平均CT值的差值=8.74-12.14=-3.398，2-ΔΔCT=10.54，即复发性流产组绒毛TIMP-1 mRNA表达量相当于正常早孕组的10.54倍(表2)。
2.2 两组mRNA相对表达量的比较
复发性流产组绒毛MMP-9 mRNA的平均表达量为4.11±0.42，相当于正常组绒毛的0.097倍(2-ΔΔCT=0.097，表2)，较正常早孕组表达明显下降，差异有统计学意义(P<0.01)；复发性流产组绒毛TIMP-1平均表达量为7.62±1.54，相当于正常早孕组绒毛的10.542倍(2-ΔΔCT=10.54，表2)，较正常早孕组表达升高，差异无统计学意义(P=0.65)(表3)。 (蒋德菊等)