细菌感染刺激在狼疮性肾炎进展中的作用研究(1)
[摘要] 目的 探讨细菌感染刺激在狼疮性肾炎(LN)进展中的作用。 方法 选取2012年12月～2014年12月青岛大学附属医院黄岛院区肾病科没有细菌感染的LN患者19例，根据疾病活动程度分为LN发作期组10例，LN缓解期组9例。另选择青岛大学附属医院查体中心的健康人10例作为健康对照组。提取并培养各组外周血单个核细胞并用CpG-ODN刺激，用ELISA检测血清及细胞上清液中的干扰素-α(IFN-α)水平。 结果 ①LN发作期患者血清IFN-α的水平[(1072.87±530.99)ng/ml]明显高于LN缓解期患者[(348.60±190.63)ng/ml，P<0.01]以及健康对照组[(293.31±214.40)ng/ml，P<0.01]。②在CpG-ODN的刺激下LN缓解期患者外周血单个核细胞上清液IFN-α水平[(2616.36±2393.76)ng/ml]明显高于LN发作期患者[(1109.37±396.66)ng/ml，P=0.024]以及健康对照组[(1121.98±370.46)ng/ml，P=0.025]。 结论 细菌感染是LN疾病加重的诱发因素。
[关键词] 狼疮性肾炎；细菌DNA；干扰素-α；外周血单个核细胞
[中图分类号] R593.2 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721(2016)04(a)-0071-04
系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)是一种累及多个器官的自身免疫性疾病，50%以上的患者有肾脏受累的表现，狼疮性肾炎(lupus nephritis，LN)是SLE较常见且严重的并发症[1]。最近有研究显示在SLE的免疫发病机制中，天然免疫系统的功能异常也起着极为重要的作用[2]。在感染和炎症时，中性粒细胞能够释放活性介质、吞噬抗体或补体结合的病原体，在天然免疫中发挥关键作用[3]。Garcia-Romo等[4]发现中性粒细胞胞外罗网(neutrophil extracellular traps，NETs)参与了SLE及LN的发生及发展。NETs是中性粒细胞的另一种杀菌形式[5]，研究表明SLE患者体内的NETs中含有自身DNA和抗菌肽，能够被Toll样受体-9(TLR-9)识别，活化浆细胞样树突状细胞(plasmacytoid dendritic cells，pDCs)[6]。而细菌的基因组中含有去甲基化胞嘧啶-磷酸鸟嘌呤(CpG)DNA回文重复序列[7-8]，人工合成的胞嘧啶-磷酸盐-鸟嘌呤基序寡脱氧核苷酸(CpG-ODN)与细菌DNA具有相似的免疫作用，都能通过TLR-9激活pDCs，释放白介素-6(interleukin-6，IL-6)、白介素-8(interleukin-8，IL-8)、干扰素(interferon，IFN)等，这些因子都有助于激活机体的免疫B淋巴细胞产生抗体，导致自身免疫性疾病的发生[9]。也有研究表明，IL-1、IL-6、IL-10以及肿瘤坏死因子等也促进SLE的发生[10]。更有研究表明，B淋巴细胞能够通过对CpG-ODN的应答参与SLE的进展及活动[11]。可见感染与自身免疫之间存在一定的关系，但是这种潜在的机制仍然尚未明确。本研究通过检测LN各期INF-α的水平及CpG-ODN刺激后INF-α的变化，旨在探讨细菌感染刺激在LN疾病进展中的作用。
1 对象与方法
1.1研究对象
选取2012年12月～2014年12月青岛大学附属医院黄岛院区肾病科LN患者19例，根据疾病活动程度分为LN发作期组10例，其中男性3例，女性7例，平均年龄(25.50±8.55)岁；LN缓解期组9例，其中男性3例，女性6例，平均年龄(26.89±10.19)岁。选取同期青岛大学附属医院查体中心的健康人10例作为健康对照组，其中男性2例，女性8例，平均年龄(36.4±14.83)岁。各组年龄、性别等一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。
1.2 LN的诊断标准
依据美国风湿病学会1997年修订的SLE分类标准，先后或同时符合四项或四项以上者可诊断为SLE[8]。在确诊SLE的基础上有肾脏受累的表现，如持续性的蛋白尿(>0.5 g/d，或>+++)或管型(可以为红细胞、血红蛋白的颗粒、管状或混合型)，并排除肾小球肾炎及其他自身免疫性疾病等[9]。LN的活动性指数应用SLE疾病活动性指数(SLEDAI)评分，本研究中LN患者发作期组SLEDAI评分>4分，LN患者缓解期组SLEDAI评分≤4分。
1.3 方法
①血清学特点：检测所有患者的C-反应蛋白(C-reactive protein，CRP)、血沉(erythrocyte sedimentation rate，ESR)、血红蛋白(hemoglobin，Hb)、血小板计数(platelet，PLT)、血清肌酐(creatinine，Cr)、血清补体C3、尿红细胞计数(urine red blood cell count，URBC)、尿白细胞计数(urine white blood cell count，UWBC)、24 h尿蛋白定量等临床指标。②IFN-α：收集各组人群新鲜外周血2 ml，4℃条件下1000×g离心20 min，取上清，储存于-80℃冰箱备用，用ELISA试剂盒检测血清的IFN-α浓度。③外周血单个核细胞的分离，刺激与培养：收集各组人群肝素化的新鲜全血20 ml，用PBS液1∶1稀释液，上层加入淋巴细胞分离液后，室温下600×g离心20 min。用一次性吸管吸取中间的云雾膜层(主要为单个核细胞)，置于新的离心管中加5倍体积以上RPMI 1640 1000×g离心10 min，弃上清，再5倍体积以上RPMI 1640 1000×g离心10 min，弃上清，将下层沉淀转移至细胞培养皿中，加适量细胞培养液并加IL-2(浓度为10 ng/ml)。将沉淀与细胞培养液混匀，平均分成2份，分别转移于新培养皿中。第1份不用任何物质刺激；第2份用CpG-ODN(浓度为3.2 mg/ml)刺激，培养7 d后收集上清液，离心，取上清，储存于-80℃冰箱备用，用ELISA试剂盒检测上清液的IFN-α浓度。IFN-α浓度的检测步骤严格按照说明书执行。④用多功能酶标仪于450 nm波长处检测OD值，以吸光度OD值为纵坐标，相应的IFN-α标准品浓度为横坐标，绘制标准曲线，可根据标准曲线换算出相应的浓度，再乘以稀释倍数，即为实际的IFN-α浓度。, http://www.100md.com(栾军军 邢广群 李远)
[关键词] 狼疮性肾炎；细菌DNA；干扰素-α；外周血单个核细胞
[中图分类号] R593.2 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721(2016)04(a)-0071-04
系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)是一种累及多个器官的自身免疫性疾病，50%以上的患者有肾脏受累的表现，狼疮性肾炎(lupus nephritis，LN)是SLE较常见且严重的并发症[1]。最近有研究显示在SLE的免疫发病机制中，天然免疫系统的功能异常也起着极为重要的作用[2]。在感染和炎症时，中性粒细胞能够释放活性介质、吞噬抗体或补体结合的病原体，在天然免疫中发挥关键作用[3]。Garcia-Romo等[4]发现中性粒细胞胞外罗网(neutrophil extracellular traps，NETs)参与了SLE及LN的发生及发展。NETs是中性粒细胞的另一种杀菌形式[5]，研究表明SLE患者体内的NETs中含有自身DNA和抗菌肽，能够被Toll样受体-9(TLR-9)识别，活化浆细胞样树突状细胞(plasmacytoid dendritic cells，pDCs)[6]。而细菌的基因组中含有去甲基化胞嘧啶-磷酸鸟嘌呤(CpG)DNA回文重复序列[7-8]，人工合成的胞嘧啶-磷酸盐-鸟嘌呤基序寡脱氧核苷酸(CpG-ODN)与细菌DNA具有相似的免疫作用，都能通过TLR-9激活pDCs，释放白介素-6(interleukin-6，IL-6)、白介素-8(interleukin-8，IL-8)、干扰素(interferon，IFN)等，这些因子都有助于激活机体的免疫B淋巴细胞产生抗体，导致自身免疫性疾病的发生[9]。也有研究表明，IL-1、IL-6、IL-10以及肿瘤坏死因子等也促进SLE的发生[10]。更有研究表明，B淋巴细胞能够通过对CpG-ODN的应答参与SLE的进展及活动[11]。可见感染与自身免疫之间存在一定的关系，但是这种潜在的机制仍然尚未明确。本研究通过检测LN各期INF-α的水平及CpG-ODN刺激后INF-α的变化，旨在探讨细菌感染刺激在LN疾病进展中的作用。
1 对象与方法
1.1研究对象
选取2012年12月～2014年12月青岛大学附属医院黄岛院区肾病科LN患者19例，根据疾病活动程度分为LN发作期组10例，其中男性3例，女性7例，平均年龄(25.50±8.55)岁；LN缓解期组9例，其中男性3例，女性6例，平均年龄(26.89±10.19)岁。选取同期青岛大学附属医院查体中心的健康人10例作为健康对照组，其中男性2例，女性8例，平均年龄(36.4±14.83)岁。各组年龄、性别等一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。
1.2 LN的诊断标准
依据美国风湿病学会1997年修订的SLE分类标准，先后或同时符合四项或四项以上者可诊断为SLE[8]。在确诊SLE的基础上有肾脏受累的表现，如持续性的蛋白尿(>0.5 g/d，或>+++)或管型(可以为红细胞、血红蛋白的颗粒、管状或混合型)，并排除肾小球肾炎及其他自身免疫性疾病等[9]。LN的活动性指数应用SLE疾病活动性指数(SLEDAI)评分，本研究中LN患者发作期组SLEDAI评分>4分，LN患者缓解期组SLEDAI评分≤4分。
1.3 方法
①血清学特点：检测所有患者的C-反应蛋白(C-reactive protein，CRP)、血沉(erythrocyte sedimentation rate，ESR)、血红蛋白(hemoglobin，Hb)、血小板计数(platelet，PLT)、血清肌酐(creatinine，Cr)、血清补体C3、尿红细胞计数(urine red blood cell count，URBC)、尿白细胞计数(urine white blood cell count，UWBC)、24 h尿蛋白定量等临床指标。②IFN-α：收集各组人群新鲜外周血2 ml，4℃条件下1000×g离心20 min，取上清，储存于-80℃冰箱备用，用ELISA试剂盒检测血清的IFN-α浓度。③外周血单个核细胞的分离，刺激与培养：收集各组人群肝素化的新鲜全血20 ml，用PBS液1∶1稀释液，上层加入淋巴细胞分离液后，室温下600×g离心20 min。用一次性吸管吸取中间的云雾膜层(主要为单个核细胞)，置于新的离心管中加5倍体积以上RPMI 1640 1000×g离心10 min，弃上清，再5倍体积以上RPMI 1640 1000×g离心10 min，弃上清，将下层沉淀转移至细胞培养皿中，加适量细胞培养液并加IL-2(浓度为10 ng/ml)。将沉淀与细胞培养液混匀，平均分成2份，分别转移于新培养皿中。第1份不用任何物质刺激；第2份用CpG-ODN(浓度为3.2 mg/ml)刺激，培养7 d后收集上清液，离心，取上清，储存于-80℃冰箱备用，用ELISA试剂盒检测上清液的IFN-α浓度。IFN-α浓度的检测步骤严格按照说明书执行。④用多功能酶标仪于450 nm波长处检测OD值，以吸光度OD值为纵坐标，相应的IFN-α标准品浓度为横坐标，绘制标准曲线，可根据标准曲线换算出相应的浓度，再乘以稀释倍数，即为实际的IFN-α浓度。, http://www.100md.com(栾军军 邢广群 李远)