范 蓓 张静静 邢体坤 刘 伟 王 斌 宋路萍 安文琪

    1.华兰生物工程股份有限公司研发部，河南新乡 453000；2.河南晟明生物技术研究院有限公司重组细胞室，河南新乡453500；3.华兰基因工程有限公司质量控制部，河南新乡 453500；4.华兰基因工程有限公司研发部，河南新乡 453500

    白细胞分化抗原47(cluster of differentiation，CD47)是一种膜蛋白，属于免疫球蛋白超家族，在正常细胞与肿瘤细胞中普遍表达。肿瘤细胞通过大量表达CD47，与巨噬细胞表面的抑制性免疫受体信号调节蛋白α(signal regulatory protein α, SIRPα)结合，抑制其吞噬作用，从而产生免疫逃逸，在肿瘤发生发展过程中表现出至关重要的作用。Hu5F9 是一种抗CD47 抗体，通过与CD47 结合，有效增强了巨噬细胞对癌细胞的吞噬作用，同时研究人员通过将互补决定区移植到人IgG4 支架上使其获得人源化改造，对人CD47 有较好的亲和力，并在体内多种肿瘤模型中表现出有效的抗肿瘤活性。哺乳动物细胞具有类似人源细胞的翻译后修饰，例如蛋白的糖基化等，因此相较于细菌、酵母、植物和昆虫等宿主细胞，哺乳动物细胞更适合表达重组蛋白药物。中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cell，CHO)是最常用的哺乳动物表达系统，能够在无血清、无蛋白的条件下进行高密度悬浮培养，可以避免血清的复杂组分的影响，提升了生产的安全性、 稳定性及法规方面的便利性，更加适合大批量工业化生产应用。同时CHO 内源性蛋白分泌较少，也更利于分离纯化目的蛋白。目前，针对SIRPα-CD47 信号通路，已有多款药物正在研究开发中，其中以Hu5F9 进度最快，研究最为全面，国内也有多家企业布局CD47 项目。本研究选用CHO-S系统来表达Hu5F9 重组蛋白，旨在为CD47 抗体药物的研究开发提供一定的实验基础。

    1 材料与方法

    1.1 材料

    pUC57-Hu5F9-H 和pUC57-Hu5F9-L 为生工 生物工程(上海)股份有限公司合成；pCGS3 空载质粒为华兰生物构建保存；CHO-S 细胞为本实验保存。

    1.2 主要试剂

    DH5α 大肠感受态(B528413)、琼脂粉(A505255)、Protein A 蛋白纯化试剂盒(C600048-0001)购自生工生物工程公司；细胞所用培养基(A29100-01、12309-019-1L)、转染试剂盒(A29129-1L、1962735)等购自Gibco 公司；蛋白胨(LP0044T)购自OXOID 公司；酵母粉(212750)购自BD公司；内切酶Hind Ⅲ(R0104V)、Pac I(R0547S)、BstB Ⅰ(R0519S)和Xho Ⅰ(R1064V)购自NEB 公司；高保真预混酶GXL Premix(R051S)、DNA 连接试剂盒(6022Q)购自Takara 公司；蛋白预制胶(M00653)、染色试剂盒(L00687R)、电泳液(M00138)、上样缓冲液(M00676、MB01015)购自金斯瑞公司；蛋白marker(26616)、Western blot 检测试剂(34577)购自赛默飞公司；Anti-Human IgG Fc specific(A0170-1ML)购自SIGMA 公司 ......