梁辉 杨金平 范银白

    1.南昌大学第二附属医院肝胆胰腺外科，江西南昌330006；2.江西省赣州市立医院麻醉科，江西赣州341099；3.江西省赣州市人民医院体检科，江西赣州 341000

    原发性肝癌简称肝癌，已跃居世界恶性肿瘤致死病因第2位[1]。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物(mam malian target of rapamycin complex，mTOR)为相对保守的丝/苏氨酸蛋白激酶，可调控细胞增殖、凋亡、自噬、迁移黏附、骨架调节等[2]，mTOR有mTORC1/2两种催化亚基形式存在，其中mTORC1对雷帕霉素敏感，而mTORC2对雷帕霉素不敏感[3]，Rictor在mTORC2所介导的肿瘤活化机制中扮演重要角色[4]。微RNA(microRNA，miRNA)可通过和下游靶基因的3′-非翻译区相结合，以调控细胞基因转录后水平，参与细胞存活率、凋亡及信号转导[5-6]。miR-424-5p为肝癌组织中低表达的新型miRNA，过表达后可抑制肝癌进展[7]。自噬是由溶酶体介导的降解途径，可降解细胞器内受损及冗余成分成小分子，供细胞再利用，对细胞内环境起维稳作用，如何诱导癌细胞自噬性死亡为肝癌治疗研究重点[8-9]。本文将研究miR-424-5p/Rictor/mTORC信号轴诱导肝癌细胞自噬性死亡的机制。

    1 材料与方法

    1.1 细胞株

    人肝癌细胞Hep-3B购自中国科学院上海细胞生物研究所。常规复苏肝癌细胞Hep-3B，细胞常规培养于Dulbecco′s改良培养基(Dulbecco′s modified eagle medium，DMEM)培养液，37℃，CO2浓度5%，隔天换液，细胞密度达50%～70%时更换为不含胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)的RPMI 1640培养基。

    1.2 仪器与试剂

    人肝癌细胞Hep-3B购自中国科学院上海细胞所；PBS缓冲液购自范德生物科技公司；miR-424-5p mimics、miR-424-5p inhibitors、Rictor过表达质粒、Rictor siRNA均购自上海吉玛制药技术有限公司；FBS购自美国Invitrogen公司；DMEM、RPMI 1640培养基购自美国GIBCO公司；100U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素购自北京Solarbio公司；转染用Lipofectamine 2000试剂购自美国Invitrogen公司；兔抗Lc3-Ⅱ抗体、兔抗Lc3-1抗体、兔抗Beclin1抗体、兔抗P62抗体购自Abcam公司；pmiR-REPORTTMLucifeRase系统购自美国Promega公司；DMSO购自美国Sigma公司；总RNA抽提试剂盒、Custom gene qRT-PCR定量试剂盒、逆转录试剂盒购自美国Fermentas有限公司；PCR引物购自上海生工公司；RIPA裂解液、BCA试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；小鼠抗GAPDH单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的二抗、FITC标记的二抗及ECL化学发光检测试剂盒购自美国Santa Cruz公司 ......