MTT法在细菌活性检测及药敏试验中的应用(2)
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2011年2月15日
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1.2.1 细菌活性检测 (1)菌液制备：挑取平板上的菌落用MH肉汤于35 ℃恒温摇床上200 r/min过夜培养，约12 h后收集细菌，用生理盐水调整细菌浓度为2.0麦氏单位(约4×108 cfu/ml)，取4 ml至无菌离心管内，于100 ℃煮沸5 min以制备死菌菌悬液，余约4 ml未煮的细菌悬液作为活菌菌悬液，用MH肉汤倍比稀释死菌和活菌菌悬液至1.00麦氏单位(约2×108 cfu/ml)、0.50麦氏单位(约1×108 cfu/ml)、0.25麦氏单位(约0.5×108 cfu/ml)和0.125麦氏单位(约0.25×108 cfu/ml)备用。(2)微量肉汤稀释法：将以上制备的各菌悬液依次加入96孔微量反应板中，每孔加200 μL，各做8个复孔，另加8孔生理盐水作为空白对照。于450 nm处测定吸光度值。(3)MTT法：将MTT(5 mg/ml)加至已接种死菌和活菌的96孔微量反应板中，每孔加20 μL，于35 ℃继续培养20 min，然后每孔加入DMSO(二甲基亚砜)100 μL，振荡10 min使甲瓒充分溶解，然后将96孔微量反应板于平板离心机中2000 r/min离心5 min，取上清200 μL移至另一96孔微量反应板，再检测570 nm处的吸光度值。
1.2.2 药敏实验 (1)菌液制备：同上将过夜培养的2株细菌调整浓度为0.5麦氏单位，各取10 μL用生理盐水稀释100倍备用。(2)药物稀释：根据临床药敏报告调整丁胺卡拉霉素和头孢他啶的终浓度(见表1)，将0.1 g/ml的高浓度药物依次稀释为终浓度的两倍，各取100 μL依次加至96孔微量板中备用。(3)细菌培养：各取10 μL已稀释好的菌悬液接种到96孔微量板的相应孔中，每一个药物浓度每一菌株每个药物浓度组均做3个重复孔，同时设定不加药物和不加细菌的空白孔、不加药物的阳性细菌对照孔和不加细菌的药物对照孔，均做3个重复孔，结果取均值进行相关分析。加样完毕后，将96孔板置恒温水浴振荡培养箱中于(35 ℃)低速振荡(50 r/min)培养。(4)结果检测：培养13 h后(细菌处于对数生长期的一个时间点)于450 nm(微量肉汤稀释法)测定吸光度值(OD值)，再按MTT法检测步骤于570 nm处测定各加样孔的吸光度值，参照向丽等[3]的方法根据吸光度值计算各药物组细菌存活率：细菌存活率=(实验组OD值-不加细菌的药物组OD值)/(不加药物的阳性细菌组OD值-空白孔OD值)×100%。结果判定：细菌存活率<30%则对该药为高度敏感(S)，细菌存活率30%～50%则对该药为中度敏感(MS)，细菌存活率>50%则对该药为不敏感(R) ......
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