肝癌干细胞差异表达miRNA的筛选及鉴定(2)
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1.3 统计学分析 各分组所得计量数据采用均数±标准差(x±s)表示，用Prism 5软件处理数据，两组间均数比较用t检验。检验水准α0.05。
2 结果
2.1 RNA提取及质量鉴定结果 Trizol一步法提取细胞中的总RNA,通过异丙醇沉淀法浓缩RNA,用分光光度计定量,样品总RNA的OD260/OD280值在1.8～2.0之间。甲醛变性琼脂糖凝胶电泳结果显示条带清晰，28S∶18S RNA条带亮度接近2∶1,RNA完好无降解,质量符合miRNAs芯片的质量要求(见表1)。
表1 RNA浓度和纯度测定
2.2 肝癌干细胞和卵圆细胞差异表达miRNAs芯片数据分析 提取卵圆细胞和肝癌干细胞的总RNA，利用microRNA芯片比较两种细胞表达miRNA差异情况。此芯片共包括人类238个microRNA，包括目前已经研究成熟的绝大部分microRNA。根据数据中上下调1.5倍筛选得到肝癌干细胞较卵圆细胞表达上调的miRNA共有14个，下调的miRNA有3个，最高表达变化达7倍。表达差异显著的miRNA共有17个。具有显著统计学差异的17种miRNA中，has-miR Plus属于尚未被miRBase数据库所记录，暂不列入研究范围；SV40-miR及hsv1-miR为病毒性miRNA也不列入研究范围。
2.3 Northern分析 为了排除由于miRNA在芯片杂交前进行扩增实验所造成的假阳性，笔者选择了6个miRNAs进行Northern杂交给予验证。包括5个高表达的miRNAs：miR-520h、hsa-miR-199a-3p、hsa-miR-122、miR-365、hsa-let-7f-2*和1个低表达的miRNA：miR-129。结果表明，与卵圆细胞相比较，肝癌干细胞中hsa-let-7f-2表达升高约5倍，hsa-miR-199a-3p、hsa-miR-122表达升高约6倍 ......
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