荧光染料CM-DiI标记大鼠骨髓间充质干细胞的体外实验(2)
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1.2 方法
1.2.1 大鼠骨髓间充质干细胞的获取、培养和扩增 无菌条件下分离大鼠股骨和胫骨，用生理盐冲洗骨髓腔，获取细胞悬液，2000 rpm离心15 min，弃上清及脂肪层。生理盐水重悬，加入比重为1.077 g/ml的Perco ll分离液，2000 rpm离心20 min，收集中间层的单个核细胞，生理盐水重悬，1000 rpm离心10 min，弃上清，将细胞用完全培养基(低糖DMEM，10%胎牛血清，10 ng/ml EGF)混悬，种植于100 mm塑料培养皿中，放入37 ℃，5% CO2、饱和湿度的培养箱中培养。24 h后首次换液，此后每3 d换液一次，待细胞长到90%融合时，用0.25%胰蛋白酶消化液进行传代。
1.2.2 骨髓间充质干细胞的荧光标记 取第4代MSCs用0.25%胰蛋白酶消化，离心收集细胞后加入PBS制成细胞悬液，用计数板计数，再将细胞平均分为实验组和对照组(每组2个复孔)。实验组按1×106>/sup>细胞量加入6 μl的CM-DiI，37 ℃孵育5 min，4 ℃冰箱内置15 min，以PBS洗涤、重悬2次，加入10%DMEM培养基中置于37 ℃、5%的CO2培养箱内培养。每天用倒置荧光相差显微镜(CM-DiI的荧光激发波长为549 nm)观察细胞生长、形态和荧光强度变化。标记后每4 d按1：2比例传代1次，标记后24 h和每次传代前于100×显微镜下随机取3个视野对阳性和阴性标记细胞进行观察、拍照和计数(700个以上细胞)，并计算细胞阳性标记率，观察期为24 d。
1.2.3 台盼蓝染色检测细胞活力 收集实验组和对照组细胞制成密度为1×106>/sup>/ml细胞悬液，取90 μl的细胞悬液和10 μl的0.4%台盼蓝混匀，在3 min内，直接镜下用细胞计数板对活细胞(细胞膜完整，拒染台盼蓝)和死细胞(细胞膜完整性丧失，被染成蓝色)计数 ......
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