eNOS第7外显子894G→T及第四内含子基因多态性与脑梗死关系的研究(2)
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1 资料与方法
1.1 一般资料 148例脑梗死患者均来自2009～2011年韶关市第一人民医院神经内科住院患者，由神经科专科医生根据详细的神经系统检查，头颅CT或MRI扫描以确诊。另选择130例与脑梗死患者年龄相当的健康体检人员作为对照组，所选样本均为血缘上的无关个体，且排除心脑血管(包括高血压)、肝、肾、甲状腺疾病及糖尿病患者。
1.2 方法 运用聚合酶链反应(PCR)技术扩增内皮型一氧化氮合酶第7外显子894G→T及第四内含子基因目的片段，总反应体积为25 μl，混匀后，分别按以下程序于PE9600型DNA扩增仪扩增目的基因，Glu298Asp：95 ℃预变性5 min后，94 ℃ 30秒，52 ℃退火45秒，72 ℃延伸45秒，35个循环后再于72 ℃延伸5 min。第4内含子VNTR:94 ℃预变性5 min后，94 ℃ 1 min，56 ℃退火60秒，72 ℃延伸60秒，30个循环后再于72 ℃延伸5 min。Glu298Asp基因多态性：位点的扩增片断长度为457bp，野生纯合子( GG 基因型) 用限制性内切酶Ban Ⅱ酶切PCR 产物后，因完全切断形成320bp，137bp 两条片段。突变杂合子( TG基因型) 因含有G→T 点突变，PCR 产物部分被酶切断，形成457bp、320bp、137bp 三条片段。突变纯合子( TT基因型) 则因完全不被切断，仅为457bp 一条片段。第4内含子VNTR基因多态性：PCR 产物通过6%聚丙烯凝胶电脉分离，EB 染色，凝胶成像仪显影，可见三种类型产物：(1)单一393bp 基因片段(4 个重复序列)，即aa纯合子；(2)单一420bp 基因片段(5 个重复序列)，即bb 纯合子；(3)393bp 和420bp 片段各一条，即ba 杂合子。基因序列分析：将PCR产物纯化后，在基因测序仪上测序。血浆纤维蛋白原浓度测定：用比浊法测定。
1.3 统计学分析 应用SPSS 13.0统计软件包和遗传学数理统计方法进行统计分析 ......
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